葛書婭，沈秋平，何積明，呂尊富，鄭海彪，李飛飛

（浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江臨安311300）

棉花是我國重要的經(jīng)濟作物，隨著棉花基因工程和轉(zhuǎn)基因育種的不斷發(fā)展，陸地棉的組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)被建立和完善[1]，轉(zhuǎn)基因育種成為棉花育種較快捷有效的途徑，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉已經(jīng)被廣泛推廣種植[2]，并帶來了很好的經(jīng)濟效益。棉花的再生方式有器官發(fā)生和體細胞胚胎發(fā)生，其中體細胞胚胎發(fā)生再生的棉花轉(zhuǎn)基因體系具有遺傳穩(wěn)定性好和嵌合體少的優(yōu)點，常被用作棉花遺傳轉(zhuǎn)化的首選途徑[3]。體細胞胚胎發(fā)生的再生體系的建立是棉花高效的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的基礎(chǔ)[4-6]。但是，棉花胚胎發(fā)生的再生途徑只在有限的陸地棉材料上獲得了成功，迫切需要擴展不同基因型棉花再生體系。基于此，選取陸地棉品種新陸早45號下胚軸作為外植體，參考已經(jīng)成功報道的愈傷組織誘導(dǎo)所需的激素，設(shè)計6種激素組合，找到新陸早45號胚軸段誘導(dǎo)愈傷組織的最佳激素組合，并進行胚性愈傷組織誘導(dǎo)，統(tǒng)計分化率，結(jié)合代謝脅迫誘導(dǎo)胚狀體的形成，提高成苗率，進而獲得再生小苗，縮短再生周期，建立并優(yōu)化新陸早45號再生體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1外植體。陸地棉品種新陸早45號的下胚軸。

1.1.2培養(yǎng)基。幼苗培養(yǎng)基（MS1）：1/2MS培養(yǎng)基。誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基 （MS2）：MS＋0.75 g·L－1MgCl2＋30 g·L－1葡萄糖＋2.0 g·L－1植物凝膠＋激素組合 （表1）。誘導(dǎo)胚性愈傷組織培養(yǎng)基（MS3）：MS ＋1.9 g·L－1KNO3＋0.75 g·L－1MgCl2＋1.0 mg·L－1天冬酰胺＋2.0 mg·L－1谷氨酰胺＋30 g·L－1葡萄糖＋2.0 g·L－1植物凝膠。分化和成苗培養(yǎng)基（MS4）：MS-NH4NO3＋0.75 g·L－1MgCl2＋1.0 mg·L－1天冬酰胺＋2.0 mg·L－1谷氨酰胺＋30 g·L－1葡萄糖＋2.5 g·L－1植物凝膠。生根培養(yǎng)基（MS5）：MS＋0.1mg·L－1NAA（萘乙酸）＋0.75 g·L－1MgCl2＋30 g·L－1葡萄糖＋2.0 g·L－1植物凝膠。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)激素組合Table 1 The hormone combinations of the callus inducing media mg·L－1

1.2 方法

1.2.1外植體的制備與愈傷組織的誘導(dǎo)。新陸早45號種子用75%（體積分數(shù)）酒精消毒30 s，30%（質(zhì)量分數(shù)）H2O2消毒3～4 h，無菌水清洗3～4次，浸泡過夜，待露白后剝?nèi)シN皮，接到幼苗培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d。將下胚軸切成0.7～0.8 cm的小段，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS2，按照每種激素組合設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)包含30個下胚軸小段，每30 d繼代1次，培養(yǎng)30 d左右，統(tǒng)計愈傷組織塊數(shù)，并計算出愈率，出愈率＝胚軸兩端傷口的出愈數(shù)/（莖段數(shù)×2）。

1.2.2胚胎發(fā)生和成苗。愈傷組織的直徑達到3～5 mm，轉(zhuǎn)接到MS3進行胚性愈傷組織誘導(dǎo)，約40 d在愈傷組織與培養(yǎng)基的接觸面產(chǎn)生細顆粒狀的胚性愈傷組織，將增殖的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接在鋪有濾紙的MS4上，誘導(dǎo)出現(xiàn)胚狀體，進一步發(fā)育成苗。這個過程每20 d繼代1次。分化率是產(chǎn)生胚性愈傷組織的愈傷組織在總愈傷組織中的占比。所有材料在溫度25～27℃，光照強度2 000 lx，每天16 h光照/8 h黑暗的條件下進行培養(yǎng)。

1.2.3嫁接成活。待再生苗莖長2～3 cm時，將其接種到生根培養(yǎng)基上。經(jīng)過約30 d的培養(yǎng)小苗會長出2～3片真葉以及一定量的根，最后采用劈接法嫁接使其成活[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合對新陸早45號愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表2可以看出，6種激素組合均能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然而不同激素組合誘導(dǎo)的愈傷組織顏色和質(zhì)地不同，出愈率也存在顯著差異。在C2、C4和C6激素組合中，新陸早45下胚軸產(chǎn)生的愈傷組織呈綠色，大多質(zhì)地堅硬（圖1B和D），少部分偏疏松（圖1F）。與C2、C4和C6激素組合相比，C1、C3和C5激素組合誘導(dǎo)的愈傷組織明顯偏黃，結(jié)構(gòu)也更疏松，生長狀態(tài)更佳（圖1A、C和D），出愈率也顯著升高。C1和C5激素組合的出愈率分別為88.3%和92.2%，顯著高于C3的81.1%，同時C1和C5誘導(dǎo)出的愈傷組織色澤和長勢也要好于C3。因此，新陸早45下胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)的適宜激素組合為C1和C5。

2.2 不同激素組合的愈傷組織分化率的比較

不同激素組合誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至MS3上誘導(dǎo)胚性愈傷組織，結(jié)果顯示，不同激素組合誘導(dǎo)出的愈傷組織具有不同的分化能力 （表2）。C1誘導(dǎo)出的愈傷組織在MS3上增殖較快，培養(yǎng)約40 d后部分疏松黃綠色的愈傷組織與培養(yǎng)基的接合面會出現(xiàn)少量灰黃色略帶紅色、細粒狀的胚性愈傷組織，這些胚性愈傷組織能進一步分化成苗，C1激素組合的分化率高達40.3%。C3和C5誘導(dǎo)的愈傷組織雖然在MS3上也增長較快，但是愈傷總體質(zhì)量較C1差，分化率分別為11.6%和25.9%。激素組合C2、C4和C6誘導(dǎo)的愈傷組織增長緩慢，質(zhì)地緊密堅硬，隨后出現(xiàn)褐變，不能分化出胚性愈傷組織。因此，C1激素組合不僅能高效誘導(dǎo)愈傷組織，而且產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)量最好，誘導(dǎo)胚性愈傷組織和分化出苗的比例高。

表2 不同激素組合對愈傷誘導(dǎo)效率的影響Table 2 Effects of various hormone combinations on callus inductionefficiency

2.3 新陸早45號再生體系的建立

圖1 不同激素組合誘導(dǎo)的愈傷組織Fig.1 Callus induced by different hormone combinations

新陸早45號下胚軸在C1激素組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后開始膨大，30 d后胚軸段的兩端出現(xiàn)明顯的愈傷組織 （圖2A），60 d后將直徑為3～5 mm疏松、黃綠色的愈傷組織轉(zhuǎn)接在MS3上進行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。在MS3上培養(yǎng)大約40 d，與培養(yǎng)基接觸的愈傷組織出現(xiàn)黃色、細顆粒狀的胚性愈傷組織（圖2B），能分化的愈傷組織大部分會長出一些根狀物，培養(yǎng)60 d后將增殖的胚性愈傷組織（圖2C）繼代到鋪有濾紙的MS4培養(yǎng)基上。在MS4培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d左右出現(xiàn)少量胚狀體（圖2D），胚狀體在MS4上進一步萌發(fā)成苗（圖2E）。整個過程需要150 d左右。再生小苗通過生根培養(yǎng)后生根，但因無強韌根系而不適合直接移栽。因此，采用嫁接的方法使其成活（圖2F）?？偣布藿恿?80棵小苗，最終成活151棵，嫁接成活率為83.9%。

3 討論

棉花胚胎再生的組織培養(yǎng)體系的建立受限于基因型的影響，不同基因型對棉花體細胞胚胎發(fā)生和植株再生具有決定性作用。目前，在棉屬的40余個種中僅克勞茨基棉、戴維遜氏棉、陸地棉、海島棉和亞洲棉這5個棉種誘導(dǎo)獲得了體細胞胚和再生植株[9]。在陸地棉中也僅限于部分基因型建立了胚胎發(fā)生的再生體系，且品種間的再生能力差異明顯。新陸早45號為我國棉花主產(chǎn)區(qū)新疆地區(qū)的主要推廣品種，對其再生體系的建立拓寬了陸地棉再生的基因型，也為棉花基因工程遺傳育種的研究奠定了基礎(chǔ)。從已報道的研究結(jié)果來看，陸地棉的胚胎發(fā)生和再生建立需要較長周期，一般6～10個月。焦天奇等[10]利用新陸早42號進行體細胞胚胎發(fā)生和植株再生，耗時約140 d；陳天子等[5]報道的新陸早33號從誘導(dǎo)愈傷組織到再生約需180 d。本試驗為了提高體細胞胚再生率，縮短再生時間，在胚狀體誘導(dǎo)階段，去除NH4NO3， 將植物凝膠含量從 2.0 mg·L－1提高到2.5 mg·L－1，同時在培養(yǎng)基表面鋪了1層無菌濾紙，造成干旱脅迫，抑制胚性愈傷組織從培養(yǎng)基上吸收養(yǎng)分，降低胚性愈傷組織增殖速度，迫使胚性愈傷組織萌發(fā)胚狀體以及成苗。一些胚性愈傷組織發(fā)生質(zhì)的改變，形成胚狀體；一些胚性愈傷組織則褐化死亡。本試驗建立了新陸早45號的胚胎發(fā)生再生體系，從誘導(dǎo)愈傷組織到獲得再生小苗歷經(jīng)約150 d，在一定程度上縮短了再生時間。

圖2 新陸早45號植株再生的流程Fig.2 Plant regeneration process of Xinluzao 45

眾所周知，植物激素是影響棉花愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的1個重要因素。在棉花下胚軸的愈傷組織的研究中常用的激素有2，4-D、NAA和IBA等生長素和KT和6-BA等細胞分裂素[11-15]。其中 0.1 mg·L－12，4-D 誘導(dǎo)的愈傷組織，具有出愈率高、愈傷組織狀態(tài)好等優(yōu)點。本試驗對新陸早45號下胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)和再生也驗證了這一點。其中下胚軸在 C1 （0.1 mg·L－12，4-D+0.1 mg·L－1KT）的激素組合下誘導(dǎo)出的愈傷組織不僅質(zhì)量最好，而且能夠高效分化出胚性愈傷組織。陳天子等[5]對4個新疆主栽品種（新陸中20、新陸早23、新陸早33和03298）的下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的結(jié)果顯示 0.02 mg·L－1或 0.1 mg·L－1KT和 0.1 mg·L－12，4-D組合的誘導(dǎo)效果最佳，且都有利于胚性愈傷組織的產(chǎn)生。劉麗等[16]對新陸早32號、33號的體細胞胚胎發(fā)生和植株再生的比較研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型的分化速度與激素組合和質(zhì)量濃度關(guān)系密切，其中基因型新陸早33號在含 0.1 mg·L－12，4-D+0.1 mg·L－1KT 培養(yǎng)基上的分化速度較快。對新陸早42號體細胞胚發(fā)生和植株再生的研究也顯示0.1mg·L－12，4-D＋0.1 mg·L－1KT激素組合誘導(dǎo)的初生愈傷組織在后續(xù)的培養(yǎng)中可出現(xiàn)胚[10]?？梢奀1（0.1 mg·L－12，4-D＋0.1 mg·L－1KT） 激素組合對誘導(dǎo)部分基因型棉花的愈傷組織比較有效。本研究中雖然下胚軸在 C3（0.1 mg·L－12，4-D＋0.5 mg·L－16-BA）和 C5 （0.1 mg·L－12，4-D＋0.5 mg·L－1IBA＋0.1 mg·L－1KT）的MS2培養(yǎng)基上也均能誘導(dǎo)出黃綠色或淡黃色、質(zhì)地疏松的愈傷組織，但是從胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段來看，C1誘導(dǎo)出的愈傷組織體細胞胚分化率最高，更加有利于植株再生。從已報道的棉花體細胞胚發(fā)生的研究來看，在胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段，外源激素或者無機鹽會造成愈傷組織向非配型愈傷組織逆轉(zhuǎn)生長[17]。因此，陸地棉不同的基因型均在無激素的培養(yǎng)基上進行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。本研究通過提高培養(yǎng)基中NO3－/NH4＋比例，有助于胚性愈傷誘導(dǎo)、胚狀體的形成以及分化成苗。上述研究結(jié)果為進一步開展新陸早45的遺傳轉(zhuǎn)化工作奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過設(shè)置6種不同激素組合，誘導(dǎo)新陸早45號下胚軸產(chǎn)生的愈傷組織及胚性愈傷組織，篩選到 C1（0.1 mg·L－12，4-D ＋ 0.1 mg·L－1KT）為誘導(dǎo)愈傷組織的最佳激素組合，愈傷組織在KNO3加倍的培養(yǎng)基上，分化出胚性愈傷組織。在去掉 NH4NO3、植物凝膠由 2.0 mg·L－1增加到2.5 mg·L－1和鋪1層無菌濾紙的培養(yǎng)基上，胚性愈傷組織進一步形成胚狀體，成苗。整個過程歷經(jīng)150 d左右。本研究建立了以下胚軸為外植體的新陸早45號的再生體系，拓展了陸地棉再生的基因型，對促進新疆棉花轉(zhuǎn)基因育種具有一定的意義。