趙紅霞，王士杰，朱繼杰，李妙，王國(guó)印

（河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所/河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，石家莊050035）

利用基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)入棉花的Bt（蘇云金芽孢桿菌）基因，可在棉花各組織器官中高效表達(dá)，合成對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)具有高效毒殺作用的蛋白[1]。實(shí)踐證明，轉(zhuǎn)Bt基因棉花殺蟲(chóng)活性高，有效控制時(shí)間長(zhǎng)，在種植過(guò)程中可有效減少用藥量，同時(shí)與其他防治措施的兼容性好[2-3]。因此，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉在國(guó)內(nèi)外迅速推廣。

隨著轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉的大面積推廣，越來(lái)越多的研究證實(shí)其抗蟲(chóng)性在棉花生育過(guò)程中表現(xiàn)不穩(wěn)定，不同階段抗蟲(chóng)性差異較大，一般是生育前期好于后期，營(yíng)養(yǎng)器官好于生殖器官。不同轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品種的殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量也存在較大差異[4]，且遺傳背景對(duì)Bt殺蟲(chóng)蛋白的表達(dá)也具有較大影響[4-5]。

轉(zhuǎn)Bt基因棉株中殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化與氮素代謝直接相關(guān)[6-7]。目前，關(guān)于環(huán)境和栽培措施引起棉花氮代謝改變對(duì)棉花殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量影響研究較多，對(duì)不同遺傳背景轉(zhuǎn)基因棉花殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量與氮代謝關(guān)系研究較少。本試驗(yàn)從與Bt蛋白合成密切相關(guān)的氮代謝入手，以轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉穩(wěn)定新品系、陸陸雜交種為研究對(duì)象，以中棉所45為對(duì)照，研究不同遺傳背景轉(zhuǎn)基因棉花殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量與氮代謝關(guān)系，為篩選高抗蟲(chóng)棉花品種提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料共41份，序號(hào)A01～A13為利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化冀668獲得的轉(zhuǎn)Bt基因穩(wěn)定品系B1～B13，A14～A26為通過(guò)常規(guī)雜交、系統(tǒng)選育獲得的冀棉20×97G1（GK12系選）后代穩(wěn)定品系J1～J13，A27～A29為自育光籽材料G1～G3，A30～A32 為自育彩棉 C1～C3，A33～A34為03～1314×零式果枝自交8代后的穩(wěn)定品系 D1～D2，A35為 8501×9685后代穩(wěn)定品系，A36 為（J11×冀 668）F1，A37 為（B12×鄂荊55173）F1，A38 為（B13×R1）F1，A39 為新棉 33B，A40為DP99B，A41為對(duì)照中棉所45。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)。2015—2016年在河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所堤上試驗(yàn)站種植。2015年4月26日播種，2016年4月25日播種。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)2次，2行區(qū)，行長(zhǎng)7.4 m，每行種植24株，區(qū)組兩邊設(shè)保護(hù)行，常規(guī)栽培管理。

1.2.2取樣時(shí)期和方法。Bt蛋白檢測(cè)取樣：在棉花苗期（4～6片真葉），2015年6月4日、2016年6月4日每個(gè)小區(qū)隨機(jī)取15株頂部第一片完全展開(kāi)葉；盛蕾期（第4果枝現(xiàn)蕾），2015年6月25日、2016年6月28日每個(gè)小區(qū)隨機(jī)取15株頂部第一片完全展開(kāi)葉和1個(gè)幼蕾（直徑0.5～0.7cm）；結(jié)鈴盛期（第4果枝結(jié)鈴），2015年7月28日、2016年7月22日每個(gè)小區(qū)隨機(jī)取15株頂部第一片完全展開(kāi)葉和1個(gè)幼鈴（直徑約1.0cm）。鮮樣用液氮冷凍后，存放于－80℃超低溫冰箱保存。

氮代謝生理指標(biāo)測(cè)定取樣：在上述取樣的同時(shí)間，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)取15株正常棉株的功能葉片（倒四葉），鮮樣用液氮冷凍后，帶回室內(nèi)剪一半鮮樣存放于－80℃超低溫冰箱用于游離氨基酸和可溶性蛋白測(cè)定，另一半用烘箱在105℃殺青30 min后，在80℃下烘干至質(zhì)量恒定用于全氮測(cè)定。

1.2.3Bt毒蛋白檢測(cè)。采用Envirologix公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定Bt毒蛋白含量。

1.2.4氮代謝生理指標(biāo)測(cè)定。用茚三酮比色法測(cè)游離氨基酸含量，用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)可溶性蛋白含量，用凱氏定氮法測(cè)全氮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同遺傳背景的抗蟲(chóng)棉品系Bt蛋白表達(dá)量差異

41份不同遺傳背景的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品系苗期幼葉、蕾期幼葉、蕾期幼蕾、鈴期幼葉和鈴期幼鈴的Bt蛋白表達(dá)量測(cè)定結(jié)果作Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)（表1），發(fā)現(xiàn)苗期幼葉、蕾期幼葉、蕾期幼蕾、鈴期幼鈴、鈴期幼葉之間均存在極顯著差異。Bt表達(dá)量的高低順序：苗期幼葉最高，其次是蕾期幼葉、蕾期幼蕾、鈴期幼鈴、鈴期幼葉（圖1），表明隨著棉花的生長(zhǎng)發(fā)育，幼葉中Bt蛋白表達(dá)量降低。生殖器官中幼蕾的含量高于幼鈴。通過(guò)對(duì)2年測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，不同遺傳背景的品系間、年份間、生長(zhǎng)時(shí)期以及各因子互作間均存在極顯著差異，表明Bt蛋白表達(dá)受環(huán)境和遺傳背景影響較大。

對(duì)40份不同遺傳背景的抗蟲(chóng)棉品系與對(duì)照中棉所45 Bt蛋白表達(dá)量差異水平作分類統(tǒng)計(jì)（表2），苗期幼葉、蕾期幼葉、鈴期幼葉Bt蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照的材料分別達(dá)到62.5%、62.5%和52.5%，而在鈴期幼鈴中Bt蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照的材料只占12%，在蕾期幼蕾中顯著高于對(duì)照的材料則沒(méi)有。

表1 不同生長(zhǎng)時(shí)期棉花Bt蛋白表達(dá)量Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)Table 1 Duncan’s test of Bt cotton protein contents at different growth periods

圖1 不同生長(zhǎng)時(shí)期棉花Bt蛋白表達(dá)量Fig.1 Contents of the Bt protein in cotton at different growth periods

2.2 不同遺傳背景的抗蟲(chóng)棉氮代謝指標(biāo)變化

2.2.1全氮含量變化。主莖功能葉中全氮含量蕾期最高，其次是鈴期、苗期（圖2），與Bt蛋白表達(dá)量變化不一致。對(duì)不同時(shí)期主莖功能葉全氮含量做Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蕾期全氮含量與鈴期和苗期之間達(dá)顯著和極顯著差異，苗期和鈴期之間無(wú)顯著差異。

2.2.2游離氨基酸含量變化。主莖功能葉中游離氨基酸含量變化趨勢(shì)與Bt蛋白表達(dá)量變化一致，在苗期、蕾期、鈴期中呈逐漸下降趨勢(shì)（圖3），且各時(shí)期間達(dá)極顯著差異。

2.2.3可溶性蛋白含量變化。主莖功能葉中可溶性蛋白含量以苗期最高，其次是蕾期，鈴期含量最低（圖4），與Bt蛋白表達(dá)量變化一致，且各時(shí)期間達(dá)極顯著差異。

2.3 Bt蛋白表達(dá)量與氮代謝相關(guān)性

將41份抗蟲(chóng)棉Bt蛋白表達(dá)量與氮代謝相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)器官中Bt蛋白表達(dá)量與可溶性蛋白和游離氨基酸含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均為0.86；與全氮含量相關(guān)性不顯著。生殖器官中Bt蛋白表達(dá)量與可溶性蛋白含量呈極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.78），與游離氨基酸和全氮含量分別呈顯著和極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.41和0.45）。

表2 不同遺傳背景的抗蟲(chóng)棉品系與對(duì)照中棉所45 Bt蛋白表達(dá)量差異比較Table 2 Comparation of Bt protein contents between insect-resistant cotton lines and CCRI 45（control）

圖2 不同棉花品系不同時(shí)期全氮含量Fig.2 Contents of total nitrogen at different growth periods among the cotton lines

圖3 不同棉花品系不同時(shí)期游離氨基酸含量Fig.3 Contents of free amino acid in different cotton lines at different growth stages

圖4 不同棉花品系不同時(shí)期可溶性蛋白含量Fig.4 Soluble protein contents of different cotton lines at different growth stages

營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中Bt蛋白表達(dá)量均與可溶性蛋白含量高度正相關(guān)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化冀668獲得的轉(zhuǎn)Bt基因穩(wěn)定品系中，可溶性蛋白含量由苗期至蕾期、蕾期至鈴期均勻下降的品系，中后期的Bt蛋白表達(dá)量超過(guò)對(duì)照，如B8（A08）等品系。苗期至蕾期可溶性蛋白含量下降幅度較大的品系，中后期Bt蛋白表達(dá)量低于對(duì)照，尤其是幼蕾幼鈴中Bt蛋白含量低，如 B1（A01）、B2（A02）等品系（表 3）。

表3 各棉花品系Bt蛋白含量差值與可溶性蛋白含量差值關(guān)系Table 3 Trends of Bt protein content differences and soluble protein content differences among the cotton lines

表3 （續(xù)）Table 3 （Continued）

在冀棉20×97G1（GK12系選）后代穩(wěn)定品系 J1～J13（A14～A26）中也出現(xiàn)相似規(guī)律，可溶性蛋白含量由苗期至蕾期、蕾期至鈴期均勻下降的品系，中后期Bt蛋白表達(dá)量高于對(duì)照，如J13（A26）、J7（A20）。不同點(diǎn)是 J1～J12（A14～A25）中可溶性蛋白含量下降幅度較大時(shí)期出現(xiàn)在蕾期至鈴期，導(dǎo)致后期幼鈴中Bt蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照，如 J12（A25）、J5（A18）等品系。

在光籽材料、彩棉、其他組合和雜交F1中，也出現(xiàn)相似規(guī)律。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)以不同遺傳背景的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉為研究對(duì)象，結(jié)果表明不同抗蟲(chóng)棉之間殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量存在較大差異，且存在時(shí)空差異，一般生育前期大于后期，營(yíng)養(yǎng)器官大于生殖器官，這與前人研究結(jié)果一致。谷淇深研究表明抗蟲(chóng)棉的抗蟲(chóng)性與Bt蛋白表達(dá)量高度正相關(guān)[4]。與對(duì)照中45相比，本研究測(cè)試材料大部分幼葉中Bt蛋白表達(dá)量高于對(duì)照，幼蕾、幼鈴中Bt蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照。因此，選育抗蟲(chóng)棉品種過(guò)程中，在考慮苗期幼葉、蕾期幼葉、鈴期幼葉Bt蛋白表達(dá)量高的前提下，重點(diǎn)將幼蕾、幼鈴中Bt蛋白表達(dá)量作為重要參考指標(biāo)。

不同遺傳背景的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉可溶性蛋白和游離氨基酸含量從苗期到蕾期、鈴期呈依次下降的趨勢(shì)，且各時(shí)期存在極顯著差異；可溶性蛋白含量與Bt蛋白表達(dá)量呈高度正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.86，當(dāng)可溶性蛋白含量從苗期至蕾期、蕾期至鈴期均勻下降時(shí)，Bt蛋白在中后期生殖器官中的表達(dá)量高。因此，可溶性蛋白檢測(cè)可作為篩選高Bt蛋白表達(dá)量棉花品種的指標(biāo)，為培育高抗蟲(chóng)品種提供重要參考。