曹俊國(guó)，陳敏，李文，李丹麗，常彤，魏海軍，許保增

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130112）

哺乳動(dòng)物的繁殖需要雄性和雌性共同參與完成，進(jìn)而將二者基因中優(yōu)秀的部分傳遞給下一代，完成物種的繁衍。在這一過(guò)程中，哺乳動(dòng)物還承擔(dān)著生育后代的功能，在生殖過(guò)程中扮演著重要的角色。哺乳動(dòng)物的生殖進(jìn)程主要包括卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育、卵母細(xì)胞的成熟及排出，即雌性配子的形成、精卵融合、胚胎的形成和著床以及妊娠的維持等[1]。卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)于繁殖力的高低具有重要意義，因?yàn)樗梢杂绊懪怕褦?shù)及后續(xù)相關(guān)的進(jìn)程。因此，深入了解哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育的分子機(jī)制和相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控作用對(duì)于解決哺乳動(dòng)物生殖不孕以及找出最佳的治療方法具有重要的意義。

1 哺乳動(dòng)物卵泡的發(fā)育

哺乳動(dòng)物的卵泡發(fā)育過(guò)程主要包含原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、三級(jí)卵泡和成熟卵泡幾個(gè)時(shí)期。原始卵泡是由一層扁平單層狀的顆粒細(xì)胞和其所包圍的未成熟的卵母細(xì)胞組成。隨著原始卵泡生長(zhǎng)啟動(dòng)后，卵母細(xì)胞周?chē)念w粒細(xì)胞由扁平單層狀變成柱狀，卵母細(xì)胞基因組被激活并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，形成初級(jí)卵泡。當(dāng)卵泡繼續(xù)發(fā)育進(jìn)入到次級(jí)卵泡階段，卵泡中的顆粒細(xì)胞由單層變成多層，次級(jí)卵泡進(jìn)一步發(fā)育變成三級(jí)卵泡，此時(shí)期主要變化是卵泡腔形成且卵泡腔內(nèi)有卵泡液。最后卵泡發(fā)育到成熟期卵泡，該時(shí)期分為選擇卵泡時(shí)期和成熟卵泡時(shí)期兩個(gè)階段。卵泡從生長(zhǎng)到成熟期主要經(jīng)歷了募集、選擇、優(yōu)勢(shì)化和閉鎖幾個(gè)重要環(huán)節(jié)。進(jìn)入募集階段的卵泡中會(huì)有一個(gè)卵泡定向發(fā)育成優(yōu)勢(shì)卵泡，同時(shí)還擁有排卵能力，這一過(guò)程被稱(chēng)為優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇。優(yōu)勢(shì)卵泡繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育，其余卵泡則自行退化，發(fā)生閉鎖。

在哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，不僅在形狀大小和功能上發(fā)生改變，而且也會(huì)受到一些與之相關(guān)的分子及信號(hào)通路的調(diào)控，包括雌激素（E）、卵泡刺激素（FSH）及黃體生成素（LH）等激素以及表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）等相關(guān)細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞發(fā)生過(guò)早黃素化與卵泡內(nèi)的LH水平較高相關(guān)，結(jié)果導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂提早發(fā)生，進(jìn)而使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生變化，最終引發(fā)卵泡閉鎖[2]。在大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，EGF可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖[3]。同時(shí)，激活素/抑制素作用通路、BMP/Smad信號(hào)通路、NPPC/NPR2信號(hào)通路、Nodal信號(hào)通路及FGF信號(hào)通路等也發(fā)揮著積極的作用。目前，人們對(duì)于相關(guān)的研究尚有欠缺，特別是信號(hào)通路中受體和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子等關(guān)鍵因子在哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育不同時(shí)期顆粒細(xì)胞中的定量表達(dá)情況尚未明確，有待更進(jìn)一步地深入研究。本文主要從激活素/抑制素作用通路、BMP/Smad信號(hào)通路以及NPPC/NPR2信號(hào)通路3種信號(hào)通路進(jìn)行相關(guān)闡述。

2 卵泡發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制

2.1 激活素/抑制素信號(hào)通路

激活素（Activin）作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforming growth factor s，TGF-s）超家族的成員，是一種主要由顆粒細(xì)胞分泌的細(xì)胞間信號(hào)分子，同時(shí)也是垂體分泌FSH的激動(dòng)劑。激活素由編碼的亞單位基因翻譯而來(lái)[4]，在結(jié)構(gòu)上，激活素是同源異構(gòu)二聚體的半胱氨酸結(jié)合蛋白，共享1個(gè) 亞單位。激活素類(lèi)型主要包括激活素A、激活素B和激活素AB 3種。從結(jié)構(gòu)上講，激活素A和B是由二硫鍵相連的二聚體，由2個(gè) 亞單位構(gòu)成，分別為 A和 B；而激活素 AB是 A-B異質(zhì)二聚體。激活素蛋白作為一種生長(zhǎng)因子，參與哺乳動(dòng)物卵巢內(nèi)多種生物學(xué)功能的改變，包括生殖細(xì)胞的生存和原始卵泡的募集、促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖及卵泡刺激素受體（FSHR）的表達(dá)、延遲卵泡黃體化和閉鎖及參與黃體溶解等[5～7]。

激活素在發(fā)揮作用時(shí)必須要有其靶細(xì)胞表面的特異性受體（Act R）的參與，與其形成三元受體復(fù)合物。激活素的受體類(lèi)型主要有I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶2種。當(dāng)信號(hào)開(kāi)始轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，激活素與II型受體結(jié)合，開(kāi)始磷酸化進(jìn)程，之后激活I(lǐng)型受體，下游的信號(hào)分子（R-Smads）磷酸化，受體Smad會(huì)與磷酸化的R-Smads結(jié)合發(fā)生位置轉(zhuǎn)移，進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)與特異性受體結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控作用（圖1）。

干細(xì)胞因子（Stem cell factor，SCF，也稱(chēng)為Kit配體，KL）由卵巢顆粒細(xì)胞分泌，并通過(guò)卵母細(xì)胞表面受體c-Kit與卵母細(xì)胞發(fā)揮作用[8]。SCF及c-Kit作為顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞發(fā)生作用的紐帶有重要的作用[9]。激活素可以通過(guò)SCF及c-Kit的紐帶作用，間接促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育。研究證明，大鼠卵巢內(nèi)的激活素 A通過(guò) smad2/ERK5/nur77信號(hào)通路促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖并提高其活性，使SCF分泌增多，然后與c-Kit發(fā)生特異性的結(jié)合，結(jié)合后的SCF/c-Kit在大鼠卵巢內(nèi)的表達(dá)水平提高，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育[10]。

同樣作為T(mén)GF-超家族成員之一的抑制素（Inhibin）是性腺分泌的一類(lèi)大分子糖蛋白質(zhì)激素，其結(jié)構(gòu)與激活素相似，只不過(guò)它是一種異二聚體結(jié)構(gòu)，沒(méi)有共享1個(gè) 亞單位，而是分別亞基和 亞基2種亞單位通過(guò)二硫鍵相連。抑制素的生理作用主要是與激活素一起調(diào)控垂體FSH的合成和分泌。許多研究表明，抑制素通過(guò)內(nèi)分泌作用調(diào)節(jié)雌激素的分泌，進(jìn)而調(diào)控垂體FSH的分泌[11，12]。該二硫鍵發(fā)揮著非常重要的作用，單獨(dú)存在亞單位和 亞單位是沒(méi)有生物活性的[13]。 亞單位有兩種類(lèi)型，即 A和 B，它們結(jié)構(gòu)上類(lèi)似，但性質(zhì)上有些差異，所以，抑制素有抑制素A（基和B亞基組成）兩種存在形式[14]。對(duì)于抑制素A，在卵基和 A亞基組成）和抑制素B（泡發(fā)育的不同階段均發(fā)揮作用，但在優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育階段和黃體形成階段表達(dá)較高。在優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育階段，抑制素A的濃度增加，加大了優(yōu)勢(shì)卵泡對(duì)FSH的敏感性，防止優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)生閉鎖；在黃體形成階段，抑制素A的主要作用是促進(jìn)卵泡黃體化，抑制素B主要在中、小竇卵泡中表達(dá)，并在早期卵泡發(fā)育階段發(fā)揮重要作用。抑制素B可以強(qiáng)化FSH抑制非優(yōu)勢(shì)卵泡進(jìn)入排卵前期，有利于優(yōu)勢(shì)卵泡篩選[15]，此外，低濃度的抑制素B與生殖機(jī)能老化也有關(guān)，如卵泡發(fā)育異常及卵泡囊腫等。研究發(fā)現(xiàn)，多囊卵巢綜合癥患者卵泡液中抑制素B水平顯著下降[16]。因此，抑制素的作用對(duì)于調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育以及調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟方式等，最終調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育發(fā)揮著重要的作用[17]。

抑制素它在阻礙激活素的作用通路方面效果顯著，抑制素通過(guò) 亞基競(jìng)爭(zhēng)性與激活素II型受體結(jié)合，導(dǎo)致激活素I型受體磷酸化受阻，進(jìn)而R-Smads激活也被阻斷，起到一種拮抗的效果。Tgfbr3是TGF-超家族的受體，也被稱(chēng)作是Betaglycan，現(xiàn)在被認(rèn)為是抑制素的共受體[18]，它與抑制素結(jié)合能增強(qiáng)抑制素與激活素II型受體結(jié)合，從而增強(qiáng)抑制素阻斷激活素作用通路[19]。

圖1 激活素/抑制素作用信號(hào)通路[20]Figure1 Activins and inhibins and their mechanism of signaling pathway

2.2 BMP/Smad信號(hào)通路

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic protein，Bmps）是一種與骨及神經(jīng)組織等形成有關(guān)的蛋白，它可以誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)定向分化成骨細(xì)胞，骨細(xì)胞進(jìn)一步分化成鈣化骨組織[21]。Bmps是TGF-超家族中一個(gè)重要成員，對(duì)于哺乳動(dòng)物骨骼形成及發(fā)育等有重要的作用。合成Bmps過(guò)程中，首先合成的是前體，前體蛋白主要包括N端引導(dǎo)序列（也稱(chēng)為信號(hào)肽）、C端成熟區(qū)以及中間區(qū)域（也稱(chēng)為前肽）3個(gè)區(qū)域。其中，C端成熟區(qū)參與多肽鏈內(nèi)部與肽鏈間二硫鍵的形成，由其所含的保守半胱氨酸執(zhí)行，并將2個(gè)多肽鏈合成未成熟的二聚體結(jié)構(gòu)，然后在蛋白水解酶的作用下形成具有活性的成熟二聚體，再與對(duì)應(yīng)的受體結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用[22]。

哺乳動(dòng)物的Bmps受體是一種膜蛋白受體，其分子結(jié)構(gòu)主要有細(xì)胞外區(qū)、內(nèi)區(qū)以及中間部分的跨膜區(qū)等幾個(gè)部分。目前，我們所知道的主要有2種，分別為 I型和 II型受體。其中，I型受體主要包括 I A（BMPR-A 或ALK-3）和 I B（BMPR-IB或ALK-6）2個(gè)亞型；II型受體有5種，分別是BMPR-II、ActR-IIA、ActR-IIB、AMHR-II和 T13R-II[23]。Bmp信號(hào)通路就是通過(guò)配體與這2種受體結(jié)合形成異源復(fù)合物，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能[24]。

Bmps家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要分為2種途徑，分別為Smads依賴(lài)型通路和磷脂酰肌醇3激酶（Phosphoinositide protein kinase PI3K）等非Smads依賴(lài)型通路。對(duì)于Smads家族，最初是從果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)的相關(guān)蛋白中提取得到的，Smads家族的每個(gè)成員在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中行使的功能會(huì)有所不同，大概可分為3種類(lèi)型：受體調(diào)節(jié)型 Smads，包括 Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8和Smad9；共同介導(dǎo)型Smads，包括Smad4；抑制型Smads，包括Smad6、Smad7，且它們主要起拮抗因子的作用[25]。哺乳動(dòng)物卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制主要受到上述Smads依賴(lài)性通路的調(diào)控，即Bmps/Smads信號(hào)通路。

Bmps家族成員及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于哺乳動(dòng)物卵泡的生長(zhǎng)、顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)分化以及卵母細(xì)胞成熟、排卵等有重要的調(diào)控作用。對(duì)于 Bmps/Smads信號(hào)通路，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模式為Bmps與細(xì)胞膜上的BMPR-II受體結(jié)合，進(jìn)而使其發(fā)生磷酸化過(guò)程，磷酸化的BMPR-II受體與 BMP-I型受體結(jié)合形成復(fù)合物，BMP-I型受體被相應(yīng)的蛋白激酶激活發(fā)生磷酸化過(guò)程，然后激活Smads信號(hào)分子，被激活的R-Smads（主要有 Smadl、Smad5、Smad8）結(jié)合共用型的 CoSmad4共同形成Smad蛋白復(fù)合物，進(jìn)入到細(xì)胞核與特異的DNA序列結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因的啟動(dòng)子，使下游基因開(kāi)始進(jìn)行轉(zhuǎn)錄[26～28]，下游信號(hào)分子 R-Smads在BMP/Smad信號(hào)通路中也占有重要地位。敲除Smad4后的小鼠，類(lèi)固醇類(lèi)激素調(diào)節(jié)被阻斷，血漿孕酮水平上升，顆粒細(xì)胞發(fā)生早熟性黃體化，最終導(dǎo)致卵巢功能早衰[29]。所以，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)BMP/Smad信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)理對(duì)于解決哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育機(jī)制及生殖不孕等關(guān)鍵問(wèn)題具有深遠(yuǎn)意義。

2.3 NPPC/NPR2信號(hào)通路

鈉尿肽家族廣泛存在于動(dòng)物大腦、心臟等各類(lèi)組織和器官中，具有維持血壓及血容量的穩(wěn)定、促進(jìn)脂肪代謝和軟骨生長(zhǎng)等多個(gè)功能[30]。該家族在哺乳動(dòng)物中主要由3種配體和3種特異性受體組成。配體以前體肽形式存在，分別是心房鈉尿肽（Atrial natriuretic peptide，ANP，又稱(chēng)為NPPA）、腦鈉尿肽（Brain natriuretic peptide，BNP，又稱(chēng)為NPPB）、C-型鈉肽（C-type natriuretic peptide，CNP，又稱(chēng)為 NPPC）；特異性受體以二聚體形式存在，分別是鈉尿肽受體A（Natriuretic peptide receptor A，NPRA，又稱(chēng)為 NPR1）、鈉尿肽受體 B（Natriuretic peptide receptor B，NPRB，又稱(chēng)為 NPR2）、鈉尿肽受體 C（Natriuretic peptide receptor C，NPRC，又稱(chēng)為 NPR3）[31]。NPPA 和 NPPB 在哺乳動(dòng)物心臟內(nèi)合成，主要是通過(guò)與血液中的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)拮抗來(lái)達(dá)到保持體內(nèi)電解質(zhì)的平衡，進(jìn)而使心血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[32]；NPPC是一種有生物活性的小分子多肽，由22個(gè)氨基酸構(gòu)成，所編碼的基因具有高度的保守性，在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂方面具有重要作用，它與NPR2有較好的親和性，可以與其特異性結(jié)合而發(fā)揮作用。3種鈉尿肽受體在哺乳動(dòng)物中均有1個(gè)細(xì)胞外配體結(jié)合域和1個(gè)單跨膜結(jié)構(gòu)，其中，NPR1和NPR2同為鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶偶聯(lián)受體，催化GTP生成細(xì)胞內(nèi)第二信使，進(jìn)而介導(dǎo)利鈉肽發(fā)揮作用；NPR3為鈉肽清除受體，與利鈉肽的清除有關(guān)[33]。

NPPC/NPR2信號(hào)通路在抑制哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞過(guò)早成熟方面發(fā)揮著巨大的作用。卵泡壁層顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的 NPPC與 NPR2結(jié)合刺激產(chǎn)生了 cGMP，cGMP通過(guò)卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的間隙鏈接進(jìn)入到卵母細(xì)胞中[34]，使磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE3A）的活性被抑制，cAMP的水解程度也隨之下降，從而穩(wěn)定在一個(gè)較高的水平，cAMP依賴(lài)的蛋白激酶PKA通過(guò)磷酸酶細(xì)胞周期蛋白（Phosphatase cell division cycle 25，CDC25）、weel激酶和髓磷脂轉(zhuǎn)錄因子Myt1，調(diào)節(jié)促成熟因子（Maturation-promoting factor，MPF）的活性，CDC25脫磷酸化周期蛋白依賴(lài)性激酶 1（Cyclin-dependent kinase 1，CDK1），weel和Myt1磷酸化CDK1，磷酸化的CDK1以及相關(guān)復(fù)合體失活，最終抑制了卵母細(xì)胞的成熟（圖2）。

圖2 NPPC及NPR2抑制卵母細(xì)胞成熟的分子機(jī)制[35]Figure 2 Mechanism of NPPC and NPR2 in the maintenance of oocyte meiotic arrest

3 展望

如今，哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育分子機(jī)制的相關(guān)研究已取得了巨大的成果。目前，已經(jīng)證明了許多信號(hào)通路在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著非常重要的作用，并且其中一些信號(hào)通路的研究已經(jīng)非常透徹。但是，還有一些信號(hào)通路的研究，如哺乳動(dòng)物是如何啟動(dòng)原始卵泡發(fā)育以及在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中又有哪些下游靶基因進(jìn)行了參與等相關(guān)的問(wèn)題仍未解決。因此，深入了解哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育分子機(jī)制的調(diào)控仍然需要對(duì)卵泡發(fā)育相關(guān)生物學(xué)及有關(guān)基因表達(dá)繼續(xù)研究，這對(duì)于治療哺乳動(dòng)物生殖不孕等疾病有重要意義。