金銀萍，艾軍，夏娟，郭靖，樸向民，王英平

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

五味子為五味子科植物五味子（Schisandra chinensis）的干燥成熟果實，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效[1]。五味子果實藥效顯著，營養(yǎng)價值高。目前，五味子除藥用外，在食品、飲料、酒、保健品等行業(yè)都被廣泛運用，市場需求量逐年增加，五味子的種植面積不斷擴大。人工栽培條件下，五味子冬季和夏季修剪是獲得高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)必不可少的技術(shù)環(huán)節(jié)。據(jù)不完全統(tǒng)計，在五味子的1個生長周期中，僅被修剪丟棄的藤莖、葉量與果實產(chǎn)量相當(dāng)，如何利用莖、葉資源，對擴大五味子資源利用范圍，增加農(nóng)民收入，保障五味子產(chǎn)業(yè)的快速健康發(fā)展具有重要意義。

研究結(jié)果表明，五味子藤莖中含有與果實類似的化學(xué)成分，4年生以上莖藤中五味子甲素、五味子乙素含量均高于果實[2～4]。藥理實驗也表明，五味子藤莖、葉的提取物具有護肝、抗菌、抗氧化等多種功效[5～7]。本試驗共收集了19種五味子優(yōu)秀品系，其中包括鑒定的新品種“嫣紅”，考察不同種質(zhì)資源五味子藤莖中4種木脂素的含量變化，并采用聚類分析法對其品質(zhì)進(jìn)行評價，為五味子藥材的綜合開發(fā)利用以及新品種的選育提供理論參考。

1 材料

1.1 試驗材料

19種不同五味子種質(zhì)資源，于2017年3月10日～3月12日采自通化國家農(nóng)業(yè)科技產(chǎn)業(yè)園五味子優(yōu)良種苗示范推廣基地，經(jīng)艾軍研究員鑒定為五味子科植物五味子〔Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.〕的藤莖。

1.2 儀器與試劑

ACQUITY超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；CPA225D 電子天平（德國 Sartorius公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（功率：500W；工作頻率：40kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化有限公司）。

五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對照品（批號分別為：110857、110764、110765）（中國食品藥品檢定研究所）；五味子醇乙（批號：YY90208，上海源葉生物科技有限公司）；乙腈（色譜純）（美國Fisher公司）；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm 50mm，流動相：乙腈（A）-水（B）；梯度洗脫程序：0min～1min、48%～50%A，1min～3min 、50%～70%A；3min～4.5min 、70%～95%A，4.5min～6.5min 、95%A，6.5min～7.0 min、95%～48%A，7min～9min 、48%A；柱溫：35℃；樣品溫度：15℃；檢測波長：254nm；流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣量：1.0；理論板數(shù)（N）：五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的N均＞5 000。而且，各成分基線分離良好，分離度＞1.5（見圖1）。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素對照品適量，置于10mL容量瓶中，甲醇超聲溶解定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為115.0/mL、64.0/mL、66.0/mL、47.0mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取五味子藤莖藥材粉末（過4號篩）2.0g，用濾紙包好，置于100mL具塞錐形瓶中，精密加入50mL甲醇，超聲提取3次，每次30min，濾過，合并濾液，減壓濃縮至干，加入適量蒸餾水溶解，用石油醚萃取，棄去萃取液，將水層減壓濃縮至干，甲醇定容至25mL棕色容量瓶內(nèi)，搖勻，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對照品儲備液適量，稀釋配制成系列濃度梯度的對照品溶液。按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定。以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)Y、對照品濃度為橫坐標(biāo)X（μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，五味子醇甲回歸方程為Y=11 600X+16 900（R2=0.999 9），11.5μg/mL～115.0μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；五味子醇乙回歸方程為Y=9 150X+7 080（R2=0.999 9），6.6μg/mL～66.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；五味子甲素回歸方程為Y=11 500X+6 810（R2=0.999 9），4.7μg/mL～47.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；五味子乙素回歸方程為 Y=8 470X+4 870（R2=0.999 8），6.4μg/mL～64.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗

取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量1.0μL，測定峰面積，計算得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的峰面積RSD分別為0.43%、0.57%、0.83%和0.66%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取同一五味子藤莖供試品溶液，室溫下放置，分別于 0h、2h、4h、6h、8h、10 h 按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的峰面積RSD分別為1.26%、1.43%、1.74%和1.61%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.6 重復(fù)性試驗

分別精密稱取同一五味子藤莖樣品 6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的峰面積RSD分別為1.27%、1.96%、2.38%、和2.08%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的五味子藤莖樣品6份，加入混合對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備加樣供試品溶液。各成分的加樣回收率和RSD分別為五味子醇甲102.22%和1.87%、五味子醇乙98.02%和2.36%、五味子甲素97.67%和2.93%、五味子乙素97.44%和2.85%。

2.8 藥材樣品含量測定

按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定樣品。結(jié)果表明，不同種質(zhì)資源五味子藤莖中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的含量與木脂素合計的變化趨于一致。不同種質(zhì)資源間五味子藤莖的木脂素類含量存在較大差異，其中五味子醇甲最高達(dá)0.752mg/g，最低為0.118mg/g，其他3種木脂素類似。以木脂素的總量為評價指標(biāo)，品系白果最佳，品系130-9-6次之。見表1。

表1 不同種質(zhì)資源五味子藤莖中4種木脂素的含量Table 1 Contents of four lignans in the stems of from different germplasm resources（n=3，mg/g）

續(xù)表1

2.9 聚類分析

以五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素4種活性成分為指標(biāo)，采用DPS 12.01統(tǒng)計軟件對19種不同種質(zhì)資源的五味子藤莖藥材進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。距離采用歐式距離，聚類方法采用最短距離法。結(jié)果顯示，19個樣本共分為5類，其中130-9-6和白果2個樣品聚為第1類，99-8-7聚為第2類，158-11-6聚為第3類，18-10-3聚為第4類，其余14種聚為第5類。見圖2。

從表1和圖2可知，質(zhì)量較好的樣本聚成了第1類，品系130-9-6和白果均聚在了這一類中，此類中木脂素含量較高，由此可以判斷出這兩個品系的五味子藤莖質(zhì)量較好。

圖2 聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram of cluster analysis

3 討論

選擇藥效成分木脂素含量高的優(yōu)良品系對于五味子藤莖的品質(zhì)評價起著至關(guān)重要的作用。本試驗收集19種不同優(yōu)良品系的五味子，應(yīng)用UPLC同時測定了五味子藤莖中4種主要的藥效木脂素類成分的含量，并通過聚類分析方法，以期優(yōu)選出最佳的五味子品系。試驗結(jié)果表明，五味子藤莖中含有與果實相同的木脂素成分，且不同種質(zhì)資源間五味子藤莖的木脂素的含量差異顯著；聚類分析結(jié)果表明，五味子藤莖品系白果和130-9-6的品質(zhì)較好，含木脂素藥效成分含量較高。