白劍宇，畢司進(jìn)，宋峰惠，史彥江

(1.新疆林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)林研究所，烏魯木齊 830063；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】阿克蘇地區(qū)棗黑斑病病原為鏈格孢菌(Alternariaalternate)[1]。該病原菌致病性強(qiáng)，傳播迅速，具有爆發(fā)性的發(fā)生特點，常常在棗果和葉片上形成黑斑，病果果肉變褐色，并向內(nèi)部延伸。棗黑斑病潛伏期長，在未表現(xiàn)出癥狀的情況下，直接觀察會提供錯誤判斷，而病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定又容易受人為因素和環(huán)境條件的干擾，加之傳統(tǒng)的分類鑒定方法熬時長、程序繁瑣，不適合快速檢測的要求，很難實現(xiàn)對病害發(fā)生動態(tài)的及時監(jiān)測和有效控制病原菌的傳播和病害流行。建立快速、準(zhǔn)確的棗黑斑病菌(A.alternata)分子檢測技術(shù)，對于探索病害防控的關(guān)鍵點以及制定適時有效的防治措施具有重要的理論和實際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自林忠敏等[2]報道了山西省棗果上發(fā)生了一種新病害，并命名為棗黑斑病以來，該病在山東、河北等[3-4]省市相繼發(fā)生，且病原種類與新疆發(fā)生的棗黑斑病的致病病原存在差異，報道的病原包括細(xì)菌中的黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)和假單胞桿菌屬細(xì)菌(Pseudomonas)[5]，真菌中的桑殼小圓孢菌(Coniothyriumfucsidμlum)、仁果莖點霉(Phomapomirum)、鏈格孢(Alternariaalternata)、細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)和莖點霉屬(Phomasp.)等[6-10]。自2008年以來，在新疆發(fā)生棗黑斑病主要危害棗樹的果實，其次為棗樹的葉片和花期，致病病原主要為A.alternaria和A.tenuissima兩種[11-13]。2016年白劍宇等[1]對阿克蘇地區(qū)發(fā)生的棗黑斑病，采用形態(tài)學(xué)觀察、致病性實驗和分子生物學(xué)相結(jié)合的鑒定技術(shù)，對致病病原進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定，明確了阿克蘇地區(qū)棗黑斑病的致病病原為A.alternaria。【本研究切入點】研究阿克蘇地區(qū)棗黑斑病菌 PCR 檢測方法的建立與應(yīng)用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究在準(zhǔn)確鑒定病原(A.alternata)基礎(chǔ)上，利用文獻(xiàn)公布的A.alternata熱休蛋白基因基因特異性引物，通過PCR反應(yīng)體系優(yōu)化后的引物特異性擴(kuò)增與靈敏度的檢測，建立棗黑斑病菌(A.alternata)的分子檢測技術(shù)，利用該技術(shù)在紅棗整個生育期對疑似棗黑斑病菌侵染的棗樹葉片和果實樣本進(jìn)行病原菌的田間追蹤檢測，并針對落葉、落果、枯枝等病殘體及土壤是否攜帶鏈格孢菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測與分析。通過病害田間侵染動態(tài)和越冬場所的分子檢測與驗證，研究棗黑斑病的田間侵染動態(tài)，分析病害防治的最佳時間，闡明棗黑斑病病原菌的越冬場所，為阿克蘇地區(qū)棗黑斑病的流行監(jiān)測和早期防治提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

棗黑斑病菌(A.alternata)為新疆林科院經(jīng)濟(jì)林研究所鑒定保存的菌株；用于引物特異性檢測的其它7個真菌菌株由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室保存并提供，包括由蕓苔生鏈格孢(Alternariabrassicae)、瓜鏈格孢(Alternariacucumerina)、長喙鏈格孢(Alternarialongirostrata)、細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)、侵染鏈格孢(Alternariainfectoria)、米曲霉(Aspergillusoryzae)和灰綠青霉(Penicilliumglaucum)。

1.1.2 供試引物

參考Margaret T. Mmbaga等[14]依據(jù)鏈格孢菌(A.alternata)的熱休克蛋白(Hsp70)序列(GenBank 登錄號：U87808)設(shè)計的特異性引物aa-hsp-f1：ATCTCTGCTAAGA- ACGCT CTCG，aa-hsp-r2：ACCAGCTCCGTAGAACTTC ATC，產(chǎn)物大小為237 bp，由北京鼎國生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.1.3 主要試劑和儀器

美國伯樂公司BIO-RAD T100 PCR儀購自美國伯樂中國上海分公司；DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑和質(zhì)粒提取試劑盒以及2×PCR反應(yīng)液等試劑購自天根生化科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 供試菌株培養(yǎng)

將各供試菌株在PDA平板上培養(yǎng)3～5 d，用打孔器打成直徑4 mm的菌餅，轉(zhuǎn)入滅菌后的馬鈴薯液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)5 d，抽濾后凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取與引物的特異性檢測

取震蕩培養(yǎng)后凍干的各供試菌株菌絲適量，液氮研磨后，分別稱取各菌株粉末50 mm，轉(zhuǎn)入2 mL離心管中。采用 CTAB 法提取總 DNA(Lee & Taylor，1990；孟鶴等，2011)作為 PCR模板，對引物(aa-hsp-f1)/(aa-hsp-r2)進(jìn)行特異性檢測。PCR 反應(yīng)體系(25 μL)：10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，10×Buffer 2.5 μL，Taq酶 0.5 μL，模板 DNA 1 μL，dd H2O 19 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃，10 min；94 ℃，1 min，60 ℃，45 s，72 ℃，2 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。

1.2.3 引物靈敏性檢測

將棗黑斑病菌(A.alternata)基因組 DNA 用紫外分光光度計測定濃度后，按10倍梯度稀釋109、108、107、106、105、104、103、102、10、1cfu/mL系列濃度，采用已建立的PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，檢測引物對(aa-hsp-f1)/(aa-hsp-r2)的靈敏度。

1.2.4 棗黑斑病田間發(fā)生動態(tài)追蹤檢測

以阿克蘇市依桿旗鄉(xiāng)8大隊2組紅棗種植園、溫宿縣萬畝棗園和阿瓦提縣多浪鄉(xiāng)紅棗示范園，3個歷年棗黑斑病發(fā)生較重的棗園為樣品采集和檢測地點，棗樹品種均為駿棗，樹齡分別為7a、9a和10a。自每年棗樹展葉起，分別于5月、6月、7月、8月、9月和10月采集疑似棗黑斑病果實和葉片樣品各50份，提取各樣品總DNA，利用已建立的PCR分子檢測體系，進(jìn)行棗黑斑病菌田間發(fā)生動態(tài)的追蹤檢測。表1

1.2.5 病原菌越冬場所的分子檢測

2016年分別與秋冬兩季收集棗園中的棗樹樹上和樹下落葉、落果等病殘體及冠下表層土壤樣本各25份，依據(jù)植物及土壤DNA提取試劑盒操作說明分別提取樣本總DNA，作為 PCR 反應(yīng)模板。利用已建立的棗黑斑病菌分子檢測技術(shù)，針對各樣本是否攜帶棗黑斑病菌進(jìn)行快速檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的特異性檢測

以滅菌后的雙蒸水為陰性對照，以 10 個供試菌株的基因組 DNA 為模板，檢測(aa-hsp-f1)/(aa-hsp-r2)引物的特異性，結(jié)果表明，以棗黑斑病菌(A.alternata)DNA 為模板，可以穩(wěn)定地擴(kuò)增出 237 bp 的單一片段(圖13)，其它6個菌株均未擴(kuò)增出條帶，且目的片段條帶明亮，擴(kuò)增穩(wěn)定性及特異性好。

注：M：100 bp Marker；1～3：鏈格孢菌；4～5：蕓苔生鏈格孢；6～7：瓜鏈格孢；8～9：長喙鏈格孢；10～11：細(xì)極鏈格孢；12～13：侵染鏈格孢；14～15：米曲霉；16～17；CK：陰性對照。

Note： M: 100 bp Marker; 1-3:A.alternata; 4-5:Alternariabrassicae; 6-7:A.cucumerina; 8-9:A.longirostrata; 10-11:A.tenuissima; 12-13:A.infectoria; 14-15:Aspergillusoryzae; 16-17:Penicilliumglaucum; CK: Negative control

圖1 棗黑斑病菌引物的特異性PCR檢測擴(kuò)增結(jié)果
Fig.1 The amplification results of black spot of jujube by PCR

2.2 引物的靈敏性檢測

棗黑斑病菌(Alternariaalternata)DNA 分光光度計測定濃度為488.6 ng/μL ，將初始 DNA 按10倍梯度稀釋至 10-5(4.886 pg/μL)仍能檢測到 DNA 的存在，說明(aa-hsp-f1)/(aa-hsp-r2)引物用于 PCR 檢測棗黑斑病菌時具有較高的靈敏度，可以用于棗黑斑病菌的田間發(fā)生動態(tài)的追蹤檢測和病原菌越冬場所的檢測與驗證。圖2

注：M：DNA Marker；1～9：DNA 依次稀釋梯度為 1～10-9；CK：陰性對照

Note： M: DNA Marker; 1 ～ 9: Serial dilution of DNA 1-10-9; CK: Negative control

圖2 棗黑斑病菌普通 PCR引物靈敏性檢測
Fig.2 Sensitivity detection of common PCR primer in black spot pathogen of jujube

2.3 棗黑斑病田間發(fā)生動態(tài)的追蹤檢測

研究表明，在不同年份不同地塊采集的病害樣本中均可檢測到棗黑斑病菌的存在，且隨著月份的增加，病原菌檢出率呈升高趨勢。其中5～6月采集的棗樹葉片樣本的病菌檢出率相對較低，最高檢出率為40%，最低檢出率為8%，而在7～10月采集的葉片樣本中病害檢出率相對較高，最高檢出率為76%，最低檢出率為44%；7～8月采集的棗樹果實樣本的病菌檢出率相對較低，最高檢出率為44%，最低檢出率為8%，而在7～10月采集的葉片樣本中病害檢出率相對較高，最高檢出率為78%，最低檢出率為52%。表1

表1 樣品材料及棗黑斑病田間發(fā)生動態(tài)檢測結(jié)果
Table 1 Specimen materials and the detection results of dynamic condition of black spot of jujube in field

采集地點Collection location采集時間Collection time樣本類型及數(shù)量Type and number of samples帶菌樣本數(shù)量Sample number of pathogen病原菌檢出率Detection rate of pathogens年度Year月份Months葉片Leaf果實Fruit葉片Leaf果實Fruit葉片Leaf果實Fruit總檢出率Total detection rate阿克蘇市依桿旗鄉(xiāng)8大隊2組2015年2016年550-14-0.28-0.28650-16-0.32-0.32750502640.520.080.308505030120.600.240.429505032340.640.680.6610505026320.520.640.58550-12-0.24-0.24650-12-0.24-0.24750502260.440.120.288505028140.560.280.429505026300.520.600.5610505030360.600.720.66溫宿縣萬畝棗園2015年2016年550-8-0.16-0.16650-18-0.36-0.36750502280.440.160.308505028180.560.360.469505034300.680.600.6410505034390.680.780.72550-4-0.08-0.08650-14-0.28-0.287505020160.400.320.368505022220.440.440.449505026260.520.520.5210505036300.720.600.66阿瓦提縣多浪鄉(xiāng)紅棗示范園2015年2016年550-14-0.28-0.28650-20-0.40-0.407505032240.640.480.568505038300.760.600.689505034360.680.720.7010505034380.680.760.72550-12-0.24-0.24650-14-0.28-0.28750502080.400.160.288505030220.600.440.529505038320.760.640.7010505036340.720.680.70

2.4 病原菌越冬場所的分子檢測

利用已建立的棗黑斑病菌分子檢測技術(shù)，針對冬春兩季收集的棗樹樹上、樹下殘留的病葉、病果及冠下表層土壤樣本是否攜帶棗黑斑病菌進(jìn)行快速的檢測，研究表明，冬、春兩季采集的病果、病葉及棗樹冠下表層土壤等病殘體均能檢測到棗黑斑病菌的存在，三者之間帶菌率存在明顯差異，其中病果帶菌率遠(yuǎn)高于病葉及表層土壤帶菌率，表層土壤樣本帶菌率最低。冬季病殘體及表層土壤樣本總帶菌率略高于春季樣本的總帶菌率，其中冬季樹上病果的帶菌率在68%～96%，樹下病果的帶菌率在80%～92%；春季樹上病果的帶菌率在76%～84%，樹下病果的帶菌率在80%～92%，而病葉無論樹上還是樹下樣本，其帶菌率均較低，最高帶菌率為56%，最低帶菌率為24%。棗樹冠下表層土壤的帶菌率最高為56%，最低帶菌率為36%，而以樹上殘留的健康棗果和葉片均未檢測到棗黑斑病菌的存在。表2

表2 棗黑斑病樣品材料及越冬場所分子檢測結(jié)果
Table 2 Specimen materials and the detection results of overwinter sites of black spot of jujube in field

采集地點Collection location樣本類型Types of samples樣本數(shù)量Number of samples帶菌樣本數(shù)量Sample number of pathogen病原菌檢出率Detection rate of pathogens (%)總檢出率(%)Total detection rate冬季春季阿克蘇市依桿旗鄉(xiāng)8大隊2組冬季樹上殘留病果252496冬季樹上殘留病葉25936冬季樹下殘留病果252288冬季樹下殘留病葉251456冬季冠下表層土壤251352春季樹上殘留病果252184春季樹上殘留病葉25624春季樹下殘留病果252392春季樹下殘留病葉251352春季冠下表層土壤25145665.661.6溫宿縣萬畝棗園冬季樹上殘留病果252080冬季樹上殘留病葉251144冬季樹下殘留病果252080冬季樹下殘留病葉251560冬季冠下表層土壤251352春季樹上殘留病果251976春季樹上殘留病葉25832春季樹下殘留病果252184春季樹下殘留病葉25728春季冠下表層土壤25114463.252.8阿瓦提縣多浪鄉(xiāng)紅棗示范園冬季樹上殘留病果251768冬季樹上殘留病葉25728冬季樹下殘留病果252392冬季樹下殘留病葉251144冬季冠下表層土壤251144春季樹上殘留病果251976春季樹上殘留病葉25728春季樹下殘留病果252080春季樹下殘留病葉25936春季冠下表層土壤2593655.251.2

3 討 論

在南疆紅棗生產(chǎn)過程中，由鏈格孢菌(A.alternata)引起的棗黑斑病不僅危害棗果，而且危害棗樹葉片和花器，受害果實多在棗果泛白期開始顯癥，而泛白期前病害癥狀不明顯，通常忽略前期對棗黑斑病的防治，僅在棗果顯癥期進(jìn)行防治，致使防治效果很難達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)。因此，利用分子檢測技術(shù)開展棗黑斑病的早期監(jiān)測，探索病害防治的關(guān)鍵時間節(jié)點顯得尤為重要。Margaret T. Mmbaga等[14]依據(jù)鏈格孢菌(A.alternata)的熱休克蛋白(Hsp70)基因序列設(shè)計出特異性引物，建立了針對A.alternata常規(guī)PCR檢測技術(shù)來鑒定和檢測病原菌。試驗在此基礎(chǔ)上利用引物對(aa-hsp-f1)/(aa-hsp-r2)對棗黑斑病菌進(jìn)行的常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為237 bp，檢測的靈敏度達(dá)到4.886 pg/μL，而且引物對(aa-hsp-f1)/(aa-hsp-r2)存在于熱休克蛋白基因片段內(nèi)，高度保守，不僅特異性強(qiáng)而且靈敏度高，具有實際可操作性，可作為棗黑斑病田間發(fā)生動態(tài)的追蹤檢測。

在棗黑斑病菌田間追蹤檢測研究中，發(fā)現(xiàn)棗黑斑病菌自5月開始侵染棗樹葉片，隨著棗樹的生長發(fā)育，葉片發(fā)生率逐漸升高，7～8月達(dá)到侵染高峰，這一定與王蘭等研究結(jié)果一致。在針對不同時期采集的棗果樣品的檢測中，發(fā)現(xiàn)棗黑斑病菌在果實泛白期前便可檢測到，由此說明病原菌在棗果泛白期已開始侵染，但仍處于潛伏期，沒有明顯發(fā)病癥狀，直到8月開始顯癥，9～10月開始大量顯癥，這與部分研究報道結(jié)果一致。但在病害調(diào)查和樣品采集中，每年的7月在棗園樹勢較弱的棗樹葉片和果實上均可采集到一種癥狀不同與棗黑斑病癥狀(黑色圓斑)的棗樹病害，經(jīng)PCR檢測，病原依然是A.alternata，這還需要進(jìn)一步的研究確認(rèn)。

通過對冬、春兩季棗園中病殘體及冠下表層土壤等樣本的檢測，發(fā)現(xiàn)棗黑斑病病菌在病果、病葉及冠下表層土壤中均可檢測出棗黑斑病的存在，其中病果檢出率最高，其次是病葉和冠下表層土壤，三者均為棗黑斑病的越冬場所。因此，及時針對越冬場所等傳染源進(jìn)行綜合處理，可作為預(yù)防和減輕病害發(fā)生程度的有效手段。此外，應(yīng)用建立的分子檢測技術(shù)開展棗黑斑病的田間侵染動態(tài)追蹤檢測，能為棗黑斑病的適時開展高效防治提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

4.1 依據(jù)Margaret T. Mmbaga等報道的鏈格孢菌(A.alternata)的熱休克蛋白基因特異性引物對(aa-hsp-f1)/(aa-hsp-r2)，通過引物特異性驗證和靈敏度檢測建立了阿克蘇地區(qū)棗黑斑病菌(A.alternata)的常規(guī)PCR分子檢測技術(shù)，該檢測技術(shù)特異性強(qiáng)，靈敏度高，具有實際可操作性，檢測靈敏度達(dá)到4.886 pg/μL ，可運用于棗黑斑病田間發(fā)生動態(tài)的追蹤檢測。

4.2 棗黑斑病菌自棗樹展葉期開始侵染棗樹葉片，7～8月達(dá)到侵染高峰，后期葉片危害減輕。棗果在果實泛白前就已開始受到棗黑斑病原菌侵染，但仍處于潛伏期，沒有明顯發(fā)病癥狀，在果實泛白期開始顯癥，9～10月以后開始大量顯癥，果實受害嚴(yán)重。

4.3 果實采收后棗黑斑病菌主要以病葉、病果等病殘體和表層土壤越冬，其中病果帶菌率最高，病葉和冠下表層土壤帶菌率較低，但仍然是棗黑斑病病原菌的越冬場所。