楊波，趙寶龍，郝小軍，都業(yè)娟，何旺

(1.特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832000；2.新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】草莓是薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)植物，其果實(shí)具有較高的營(yíng)養(yǎng)及保健價(jià)值。草莓也已成為我國(guó)乃至世界廣泛栽培的重要經(jīng)濟(jì)作物。截止到2015年，我國(guó)草莓栽培面積達(dá)12.93×104hm2，總產(chǎn)量達(dá)347.9×104t，種植面積和產(chǎn)量均居世界第一位[1]。新疆草莓栽培自20世紀(jì)30年代，草莓生產(chǎn)取得較大發(fā)展，南北疆各地區(qū)均有種植[2]。草莓為多年生常綠草本，主要靠匍匐莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，在長(zhǎng)期無(wú)性分株過(guò)程中，很容易感染病毒并在植株內(nèi)積累，造成草莓品種植株矮化，匍匐莖減少，結(jié)果能力減弱，果實(shí)品質(zhì)變差，產(chǎn)量下降等種性退化。草莓一旦感染病毒，多是代代相傳，病毒病可造成草莓減產(chǎn)30%～80%[3]。因此，調(diào)查與檢測(cè)新疆草莓主栽區(qū)病毒病發(fā)生情況，對(duì)推進(jìn)新疆草莓無(wú)病毒種苗的生產(chǎn)和應(yīng)用具有實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，世界上已報(bào)道的草莓病毒病多達(dá) 25 種，主要有草莓斑駁病毒病(strawberrymottlevirus，SMoV)、草莓鑲脈病毒病(Strawberryveinbandingvirus，SVBV)、草莓輕型黃邊病毒病(Strawberrymildyellowedgevirus，SMYEV)、草莓皺縮病毒病(Strawberrycrinklevirus，SCV)等[4,5]。我國(guó)于20世紀(jì)80年代末開始對(duì)草莓部分病毒進(jìn)行調(diào)查和鑒定。鄭巧兮、王國(guó)平等[6-9]分別通過(guò)電鏡觀察和嫁接指示植物方法，對(duì)上海、遼寧、山東、河北、陜西、甘肅各地草莓進(jìn)行調(diào)查鑒定，主要有草莓斑駁病毒(strawberrymottlevirus，SMoV)、草莓輕型黃邊病毒(Strawberrymildyellowedgevirus，SMYEV)、草莓鑲脈病毒(Strawberryveinbandingvirus，SVBV)和草莓皺縮病毒(Strawberrycrinklevirus，SCV)四種病毒，帶毒率最高達(dá)99%，并且多以復(fù)合感染為主。高慶玉等[10]對(duì)黑龍江省草莓病毒病種類進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)四種病毒也多以復(fù)合感染形式存在。韋石泉、吳元華等[11,12]對(duì)遼寧遼陽(yáng)、沈陽(yáng)、興城、朝陽(yáng)，吉林長(zhǎng)春、四平、通化、大連、丹東、黑龍江哈爾濱、河北保定、江蘇南京及湖北武漢草莓斑駁病毒以及草莓鑲脈病毒調(diào)查發(fā)現(xiàn)，SMoV和SVBV的單獨(dú)感染率也分別在90%和20%以上。王運(yùn)生等[13]對(duì)北京、浙江、四川、河北等不同地區(qū)草莓進(jìn)行初步調(diào)查及RT-PCR檢測(cè)，SVBV、SMoV、SCV、SMYEV在不同品種間均有發(fā)生，并且SVBV發(fā)生最為普遍?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】調(diào)查檢測(cè)范圍有限，僅僅局限我國(guó)內(nèi)地部分省市地區(qū)。近年來(lái)，隨著新疆設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展，以草莓為主題的觀光農(nóng)業(yè)也迅速發(fā)展，病毒病是影響草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要因素。但關(guān)于新疆該地區(qū)草莓病毒病發(fā)病情況以及病毒種類相關(guān)研究未見報(bào)道。研究檢測(cè)與調(diào)查新疆地區(qū)四種草莓病毒病原?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用草莓上4種主要病毒特異性引物，通過(guò)RT-PCR對(duì)南北疆主栽區(qū)的草莓進(jìn)行檢測(cè)，分析不同地區(qū)草莓病毒種類以及草莓帶毒情況，為新疆草莓無(wú)病毒苗的生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2017年4～5月，從新疆烏魯木齊、伊犁、哈密、庫(kù)爾勒、阿克蘇和石河子等草莓主栽區(qū)15個(gè)采樣地，隨機(jī)采取450株草莓樣品，采回的樣品保存-80℃冰箱。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[14,15]設(shè)計(jì)引物，委托生工生物工程(上海)有限責(zé)任公司合成。表1

表1 四對(duì)草莓病毒特定引物序列
Table 1 Specific primers sequences of four strawberry viruses

1.2.2 草莓總RNA提取和cDNA合成

應(yīng)用艾德萊公司RN09-EASYspin 植物RNA快速提取試劑盒(RN0902)提取草莓總RNA。所提RNA通過(guò) 0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。采用艾德萊公司PC18-TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒)合成cDNA，步驟參考說(shuō)明書，將得到的cDNA保存在-20℃冰箱待用。

1.2.3 草莓病毒病單一RT-PCR檢測(cè)

反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，用含Taq酶的2×TaqPCR Master Mix(艾德萊)進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系中含2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)程序如下：(1)B1/B2、Q1/Q2、A1/A2引物對(duì)：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸5 min，4℃保存。(2)X1/X2引物對(duì)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸5 min，4℃保存。(3)Z1/Z2引物對(duì)：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸40s，35個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 三種病毒多重PCR體系建立

利用單一RT-PCR檢測(cè)獲得同時(shí)感染SMoV、SMYEV和SVBV的草莓樣品cDNA為模板，同一體系加入三對(duì)引物進(jìn)行多重PCR。反應(yīng)采用20 μL體系，以退火溫度和引物濃度為探索條件，退火溫度設(shè)5個(gè)水平即53、54、55、56和57℃，使用引物(濃度均為 10 mM)按不同用量組合。對(duì)單一條件優(yōu)化時(shí)，其他因素都不變。由于SVBV片段與SMoV和SMYEV擴(kuò)增片段相比較長(zhǎng)，多重PCR反應(yīng)程序延伸時(shí)間以SVBV程序?yàn)橹鳌＝?jīng)過(guò)多重PCR擴(kuò)增好的產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。挑選出條帶清晰、條帶指示正確的最優(yōu)組合為多重PCR反應(yīng)體系和程序。用其他同時(shí)感染草莓斑駁病毒病、草莓輕型黃邊病毒病和草莓鑲脈病毒病的樣品進(jìn)行單一PCR對(duì)比，驗(yàn)證多重RT-PCR可靠性和實(shí)用性。表2

表2 多重RT-PCR擴(kuò)增3種草莓病毒引物濃度設(shè)置
Table 2 Concentration of primers for 3 strawberry viruses amplified by multiplex RT-PCR

病毒Virus濃度設(shè)置 Concentration setting (μL)12345SMoV0.350.400.400.350.35SMYEV0.350.400.350.250.40SVBV0.350.350.250.300.30

1.2.5 新疆草莓主栽區(qū)病毒病調(diào)查

用單一RT-PCR和多重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)草莓斑駁病毒病、草莓輕型黃邊病毒病和草莓鑲脈病毒病，統(tǒng)計(jì)并分析新疆草莓主栽區(qū)病毒病感染情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓總RNA的提取和檢測(cè)

應(yīng)用試劑盒提取草莓總RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可以看出28S和18S條帶清晰可見，完整性較好。應(yīng)用分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度在 500 ng/μL以上、OD260/OD280在2.0～2.2，所提RNA濃度和純度較高。圖1

2.2 單一RT-PCR檢測(cè)草莓病毒病

應(yīng)用四種病毒的特異性引物對(duì)反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠瓊脂糖電泳，SMoV、SMYEV和SVBV特異性引物擴(kuò)增結(jié)果分別獲得與目的條帶大小(分別為219 bp、547 bp和271 bp)一致的條帶。分別對(duì)目的片段進(jìn)行凝膠回收、測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBack中進(jìn)行相似性比對(duì)，序列結(jié)果顯示與NCBI上已上傳的的SMoV、SMYEV和SVBV序列相似性分別為96%、93%和95%以上，說(shuō)明PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段為相應(yīng)的病毒基因片段。而用SCV特異性引物對(duì)所有樣品進(jìn)行檢測(cè)，未擴(kuò)增出目的片段，說(shuō)明采集的樣品中不含有草莓皺縮病毒。圖2

注：1～4: 4個(gè)不同草莓樣品

Note： Lane 1-4: Four different strawberry samples

圖1 草莓組培苗葉片總RNA

Fig.1TotalRNAofStrawberrytissueculture

注：M：DL 2 000；N：陰性對(duì)照；1：SMoV；2：SVBV；3：SMYEV

Note： Lane M:DL 2,000; Lane N:Negative control; Lane 1:SMoV; Lane 2:SVBV; Lane 3: SMYEV

圖2 草莓三種病毒單一PCR
Fig.2 Simple PCR detection of three strawberry viruses

2.3 多重RT-PCR檢測(cè)草莓病毒病檢測(cè)體系建立

根據(jù)單一RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果，利用現(xiàn)有引物嘗試建立同時(shí)檢測(cè)三種病毒的多重RT-PCR，主要對(duì)多重RT-PCR檢測(cè)體系引物退火溫度和引物用量進(jìn)行優(yōu)化。其他反應(yīng)因素不變條件下，對(duì)退火溫度(53～57℃)進(jìn)行篩選，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。研究表明，隨著退火溫度增加SMYEV和SVBV條帶逐漸清晰；而SMoV隨著退火溫度(53～55℃)的增加條帶逐漸清晰，當(dāng)溫度超過(guò)55℃時(shí)，則SMoV條帶逐漸模糊。綜合考慮三種病毒引物擴(kuò)增結(jié)果，研究選擇最適退火溫度為55℃。

同時(shí)也對(duì)三對(duì)引物(SMoV、SMYEV、SVBV)依次加入量進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)分別加入0.35、0.35和0.35 μL時(shí)，研究表明，SMYEV和SMoV的條帶較弱(泳道1)；當(dāng)SVBV不變，SMYEV和SVBV引物各增加0.05 μL結(jié)果顯示SMYEV和SVBV條帶都亮，SMoV較弱(泳道2)；增加SMoV的引物量，SMYEV引物量不變并減少SVBV引物量，結(jié)果顯示，SMYEV、SVBV和SMoV條帶亮度基本相近(泳道3)；減少SMYEV和SVBV引物量，SMoV和SMYEV條帶都較弱(泳道4)；增加SMYEV并減少SVBV的引物量，SMoV仍然較弱(泳道5)。因此，研究使用多重PCR體系SMoV、SMYEV和SVBV三種引物配比為0.4∶0.35∶0.25。圖3，圖4

注：M：DL 2 000；N：陰性對(duì)照；1～5：53、54、55、56和57℃

Note： Lane M:DL 2,000; Lane N:Negative control; Lane 1-5:53, 54, 55, 56 and 57℃

圖3 多重RT-PCR退火溫度優(yōu)化
Fig.3 Optimization of anneal temperature of the multiplex RT-PCR

注：DL 2 000；N：陰性對(duì)照；1～5：不同濃度組合

Note： Lane M:DL 2,000; Lane N:Negative control, Lane 1-5:Different concentration combinations

圖4 多重RT-PCR引物濃度優(yōu)化
Fig.4 Optimization of primer concentration of the multiplex RT-PCR

2.4 多重RT-PCR檢測(cè)

對(duì)采集的新疆草莓主栽區(qū)樣品進(jìn)行SoMV、SMYEV和SVBV多重RT-PCR檢測(cè)。對(duì)多重RT-PCR檢測(cè)同時(shí)單一RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，多重RT-PCR和單一RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明建立的多重RT-PCR體系快速、特異地檢測(cè)3種病毒。圖5

注：M：DL 2 000；1～17：17個(gè)草莓樣

Note： Lane M: DL 2,000; Lane 1-17: Seventeen strawberry samples

圖5 17個(gè)草莓樣品檢測(cè)結(jié)果
Fig.5 Test results of 17 strawberry samples

2.5 新疆草莓主栽區(qū)草莓病毒病檢測(cè)

利用4種病毒病的特異性引物對(duì)采自新疆草莓主栽區(qū)的 450 份樣品進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。南北疆各地區(qū)采集的樣品均檢測(cè)出含有SMoV、SMYEV和SVBV三種病毒，SCV病毒未檢出，病毒總檢出率為 64.22%，總檢出率達(dá) 90% 以上的采集地有安寧渠鎮(zhèn)、鞏留縣以及和靜縣；檢出率較低的十三師各團(tuán)場(chǎng)和一師各團(tuán)場(chǎng)，病毒總檢出率也在25%以上。在所有樣品檢測(cè)的3種病毒中，SVBV總檢出率最高，為51.78%，檢出率較高的采集地有安寧渠鎮(zhèn)、鞏留縣與和靜縣，檢出率分別為76.67%、76.67%和73.33%；所有采集地均能檢測(cè)出SMoV，總檢出率為23.78%，安寧渠鎮(zhèn)、青格達(dá)湖鄉(xiāng)、鞏留縣以及和靜縣檢出率均在40%以上；SMYEV總檢出率9.33%只有阿瓦提縣、十三師各團(tuán)場(chǎng)與一師各團(tuán)場(chǎng)三個(gè)采集地未檢出SMYEV。三種病毒在南北疆分布沒有規(guī)律，不同采集地病毒檢出率差異明顯，同一采集地三種病毒檢出率差異較大。表3

表3 各地不同品種病原病毒檢出率
Table 3 Detection rates of various pathogenic viruses in different regions and varieties

采樣地Location樣品數(shù)(份)Number of samples各種病毒檢出率Detection rate of various viruses (%)SMoVSMYEVSVBVSCV各地病毒總檢出Total detection rates of viruses (%)安寧渠鎮(zhèn)(河西村)30401076.67093.33十二師各團(tuán)場(chǎng)3016.676.6660066.67烏魯木齊縣南山3016.673.3346.67063.33青格達(dá)湖鄉(xiāng)30401063.33083.33伊寧縣3033.332066.67086.67鞏留縣30503076.67093.33特克斯縣3016.676.6740050霍城縣303013.3360080察布查爾錫伯族自治縣3016.673.3340053.33四師各團(tuán)場(chǎng)30106.6756.67063.33十三師各團(tuán)場(chǎng) 306.67023.33026.67和靜縣30402073.33090一師各團(tuán)場(chǎng)303.33026.67026.67阿瓦提縣3013.33023.33030八師各團(tuán)場(chǎng)3023.331043.33056.67合計(jì)45023.789.3351.78064.22

通過(guò)對(duì)所有樣品感染三種病毒的復(fù)合侵染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，檢測(cè)結(jié)果顯示，感染兩種及兩種以上病毒檢出率為18.45%，其中，SMoV和SVBV復(fù)合侵染最為普遍，總檢出率為10.89%；SMYEV與SVBV以及SMoV與SMYEV復(fù)合侵染檢測(cè)率分別為4.22%和1.56%；同時(shí)感染SMoV、SVBV和SMYEV三種病毒的采集地只有安寧渠鎮(zhèn)、伊寧縣、鞏留縣、霍城縣、和靜縣和八師各團(tuán)場(chǎng)，總檢出率為1.76%。表4

表4 各病原病毒復(fù)合侵染率
Table 4 Complex infection rates of various pathogenic viruses

采樣地Location復(fù)合侵染率 Complex infection rates(%)SMoV+SMYEVSMoV+ SVBVSMYEV+ SVBVSMoV+SMYEV+ SVBV安寧渠鎮(zhèn)(河西村)3.33203.333.33十二師各團(tuán)場(chǎng)0103.330烏魯木齊縣南山03.3300青格達(dá)湖鄉(xiāng)3.3323.333.330伊寧縣3.3313.33103.33鞏留縣6.6726.6716.676.67特克斯縣06.673.330霍城縣0106.673.33察布查爾錫伯族自治縣03.333.330四師各團(tuán)場(chǎng)06.673.330十三師各團(tuán)場(chǎng)03.3300和靜縣3.3323.33103.33一師各團(tuán)場(chǎng)03.3300阿瓦提縣06.6700八師各團(tuán)場(chǎng)3.333.330.006.67合計(jì)1.5610.894.221.78

3 討 論

草莓在長(zhǎng)期無(wú)性繁殖過(guò)程中，很容易感染病毒，并且感染草莓的病毒大多具有潛隱特點(diǎn)，單一病毒侵染時(shí)一般不表現(xiàn)癥狀，只有多種病毒復(fù)合侵染時(shí)植株葉片才表現(xiàn)花葉、皺縮、褪綠黃化以及植株矮化等典型癥狀[16,17]。因此，田間診斷很難確定病原。

目前，草莓病毒鑒定的方法主要有指示植物小葉嫁接法、電鏡檢測(cè)法、血清法檢測(cè)法和分子生物學(xué)檢測(cè)法[18]。分子生物學(xué)因其靈敏度高(能檢測(cè)到pg甚至fg水平的病毒)、特異性強(qiáng)、快速、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，尤其RT-PCR和多重RT-PCR在草莓病毒鑒定方面應(yīng)用及其廣泛[14-15,19,20]。研究利用RT-PCR和多重PCR方法對(duì)新疆草莓主要種植區(qū)樣品，發(fā)生最普遍以及危害最為嚴(yán)重的四種病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，該地區(qū)草莓感染多種病毒，4種病毒的檢出率SVBV較多，SMoV次之，SMYEV較少，SCV未檢出。南北疆不同地區(qū)樣品帶毒率差異較大，同一地區(qū)不同采集地樣品帶毒率也比較明顯，并且發(fā)病率較高的地區(qū)草莓多為自繁苗，如烏魯木齊安寧渠鎮(zhèn)、伊犁鞏留縣、南疆和靜縣；引進(jìn)外地脫毒苗的種植區(qū)如十三師各團(tuán)場(chǎng)、阿克蘇第一師各團(tuán)場(chǎng)、阿瓦提縣等草莓病毒種類較少帶毒率較低。因此，推廣使用脫毒種苗是減少草莓病毒病原最有效的手段。新疆草莓主要栽培品種多從北京、山東等省(市)引進(jìn)[21,22]，研究對(duì)新疆草莓病毒病原的檢測(cè)與調(diào)查結(jié)果，卻和北京、山東等地的調(diào)查結(jié)果存在差異，內(nèi)地調(diào)查結(jié)果多發(fā)現(xiàn)SVBV、SMoV、SMYEV以及SCV共同感染草莓，而此次對(duì)南北疆15個(gè)不同地區(qū)采集的草莓樣品進(jìn)行檢測(cè)，并沒有發(fā)現(xiàn)SCV[7,9,13]。新疆由于其獨(dú)特的地理位置以及草莓病毒病種類與分布的復(fù)雜性，在新疆草莓種植區(qū)栽培的草莓是否感染其它種類的草莓病毒有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

2017年，新疆草莓主栽區(qū)病毒病發(fā)生率較高，病毒總檢出率64.22%，其中鑲脈病病毒病檢出率最高，總檢出率為51.78%；斑駁病毒病和輕型黃邊病毒病檢出率分別為23.78%和9.33%。南北疆不同草莓栽培區(qū)以及相同栽培區(qū)不同采集地樣品病毒檢出率差異較大，無(wú)明顯的地域特征。在危害草莓最為嚴(yán)重的4種病毒SMoV、SMYEV、SVBV和SCV中，SMoV、SMYEV和SVBV這三種病毒在全疆主栽區(qū)均有發(fā)生，并且病毒復(fù)合侵染率較高。