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(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030; 2.黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責(zé)任公司,黑龍江佳木斯 154002)

生物酶法制油作為一種新興的“綠色、環(huán)?！碧嵊图夹g(shù),在提取油脂的同時，能高效地回收油料中其他價值組分,與傳統(tǒng)工藝相比,在能耗、環(huán)境和安全衛(wèi)生等方面具有顯著優(yōu)勢,且具有操作條件溫和、工序簡單、低能耗、低污染等優(yōu)點(diǎn)[1-4]。目前,國內(nèi)外學(xué)者針對大豆水酶法的研究主要集中在其預(yù)處理方法、酶解工藝條件、乳狀液破除、油脂釋放機(jī)制及油脂品質(zhì)研究等方面。目前,對于大豆加工過程副產(chǎn)物的研究主要集中在豆腐、豆?jié){殘?jiān)?而針對生物酶法制油豆渣的相關(guān)研究較少,對豆渣組分中蛋白結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理及潛在生物活性更是鮮有研究[5-8]。

超微粉碎及螺桿擠壓改性處理技術(shù)是大豆加工副產(chǎn)物的深加工技術(shù),超微粉碎處理使豆渣具有一般顆粒所沒有的特殊理化性質(zhì),如良好的溶解性、分散性、吸附性、化學(xué)反應(yīng)活性等[9-11]。有研究證實(shí),超微粉碎能夠促進(jìn)大豆原料中蛋白質(zhì)的提取[12]。Le等[13]研究了粒度對豌豆粉蛋白質(zhì)提取率的影響,發(fā)現(xiàn)隨著粉碎程度的降低,面粉的平均粒度增加,而豌豆粉提取的蛋白質(zhì)量從73.6%下降到37.4%。Russin等[14]研究發(fā)現(xiàn)，不同研磨篩處理脫脂豆粉會導(dǎo)致其蛋白提取率不同,說明粒度對蛋白回收有明顯影響。

綜上所述,超微粉碎對植物蛋白分離、回收及理化性質(zhì)影響顯著,與其他方法相比,超微粉碎具有技術(shù)簡單、低成本和可持續(xù)性的優(yōu)勢,但由于超微粉碎的高速剪切作用使得體系溫度升高,而溫度過高會導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)功能變化,因此,為減小高溫對蛋白構(gòu)象的影響,本研究采用低溫超微粉碎處理生物酶法制油的豆渣,應(yīng)用二維及三維熒光光譜法分析不同處理?xiàng)l件下豆渣蛋白的結(jié)構(gòu)變化,并通過豆渣蛋白界面性質(zhì)、溶解性、粒度分析及ζ-電位對其功能性質(zhì)進(jìn)行表征,初步探究低溫超微粉碎對生物酶法制油豆渣蛋白的作用機(jī)制,旨在通過低溫超微粉碎這種簡單處理方式提高豆渣蛋白品質(zhì),促進(jìn)生物酶法副產(chǎn)物二次利用,填補(bǔ)該領(lǐng)域研究空缺,為生物酶法豆渣蛋白的分離、純化及回收提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 哈爾濱高科技(集團(tuán))股份有限公司;堿性蛋白酶Protex6L(8900 U/mL) 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Lowry法測溶解度試劑盒 上海荔達(dá)生物科技有限公司;其它試劑 均為分析純。

S22-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司;AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;PHS-3C雷磁pH計 上海精科;SWFJ型超微粉碎機(jī) 廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司;TDL-408臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;HH-4型數(shù)顯攪拌水浴鍋 常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠;DHG-9620A型鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;F-4500型熒光分光光度計 日本日立公司;Zetasizer Nano-ZS90型激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 低酶體系酶法制油豆渣的制備 參照Li 等[15]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改,將大豆粉碎過60目篩,過篩后按料液比為1∶6 (m/V)加入200 g蒸餾水待攪拌均勻后放入55 ℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行酶解,酶解條件為:酶解溫度55 ℃、酶解時間2 h、pH維持在9.0、堿性蛋白酶Protex6L(8900 U/mL)添加量為0.5%,邊攪拌邊酶解,酶解結(jié)束后,取出并用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)水溶液pH至7,之后在100 ℃沸水中滅酶5 min,將滅酶后的溶液在4500 r/min,20 min條件下離心操作,豆渣在平板鋪平后置入55 ℃鼓風(fēng)烘箱待恒重后取出研磨即得所需酶法制油豆渣,即未處理豆渣。

1.2.2 低溫超微粉碎處理豆渣 由于豆渣中的脂肪氧化后會產(chǎn)生異味并影響提取率[16],按照楊夢曦等[17]的處理方法除去脂肪。然后,采用超微粉碎機(jī)在-4 ℃下超微粉碎酶法制油豆渣(水分≤4%),粉碎時間30 s,出料粒度分別為100、200、300目,然后在55 ℃下烘干至質(zhì)量恒定。常溫超微粉碎豆渣樣品條件為:溫度25 ℃、出料粒度為200目。

1.2.3 豆渣蛋白的提取工藝 根據(jù)Petruccelli等[18]的方法。取150 g豆粉用正己烷以1∶6 (m/V)的比例混合脫脂3次得到脫脂豆粕,將脫脂豆粕按1∶10 (m/V)的質(zhì)量比與水混合,用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5,45 ℃攪拌2 h后,將其懸浮液在4 ℃條件下10000×g離心20 min,取上清液再用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至豆渣蛋白等電點(diǎn)4.5。靜置后在4 ℃條件下6000×g離心20 min,得蛋白沉淀水洗2次,最后取沉淀分散于水中并用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。再在4 ℃條件下10000×g離心30 min,除去少量的不溶物,將此蛋白溶液冷凍干燥后研磨即得粉末狀豆渣蛋白。

1.2.4 粒徑分布及ζ-電位的測定 根據(jù)Tang等[19]的測定方法,利用進(jìn)行粒徑分布及ζ-電位測定。

1.2.5 乳化活性(EA)和乳化穩(wěn)定性(ESI)的測定 乳化性能的測定根據(jù)Tang和Kinsella等[20-21]的方法取一定體積濃度為0.5%的蛋白質(zhì)溶液,加入同體積的葵花籽油,以10000 r/min的速度高速攪拌1 min,之后分別在0、10 min 取樣,用0.1%(m/v)SDS(十二烷基磺酸鈉,pH7.0)稀釋100倍,以SDS溶液為空白,測定 500 nm 處的吸光度值,以0 min的吸光度值(A0)表示EAI,乳化穩(wěn)定性用ESI表示。

EAI=A0

式中:A0:0時刻的吸光值;ΔT:時間差(min);ΔA:ΔT內(nèi)的吸光值差。

1.2.6 起泡性、泡沫穩(wěn)定性的測定 根據(jù)Aewsiri等[22]的發(fā)泡性能測定方法,取50 mL 3%(m/v)豆渣蛋白懸浮液用高速分散器以10000 r/min的速度攪打1 min,用10 mL蒸餾水清洗刀具,洗液小心并入起泡液中,記錄攪打前后的體積。起泡能力用體積增加的百分比表示。隨后,將攪打起泡的樣品靜置10、20、30 min,記錄不同時間段的泡沫體積,其中所有實(shí)驗(yàn)平均測量3次。

式中:FC:起泡能力(%);FS:起泡穩(wěn)定性(%);V1:攪打前的體積mL);V2:攪打后的(mL)。

1.2.7 豆渣蛋白溶解性的測定 根據(jù)Messinger等[23]的方法加以改進(jìn)。將豆渣蛋白溶于去離子水中,分別配成1%、2%、3%、4%(m/v)的豆渣蛋白溶液。精確稱取10 mL豆渣蛋白溶液,在4500×g條件下離心15 min。上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后,應(yīng)用Lowry法測定上清液蛋白含量,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,用凱氏定氮法測定樣品總蛋白含量。

1.2.8 熒光光譜分析 根據(jù)Zhang等[24]的測定方法,使用熒光光譜儀測定樣品的熒光光譜。配制50 mL,10 mg/mL的豆渣蛋白溶液,用磷酸鹽緩沖溶液稀釋100倍后，取適量稀釋樣品置于石英比色皿中測定。二維熒光測定參數(shù)為:掃描發(fā)射波長為300～500 nm之間,激發(fā)波長為280 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm;三維熒光光譜的連續(xù)掃描記錄發(fā)射波長為200～500 nm。起始激發(fā)波長為200 nm,增長間隔為10 nm,掃描16條曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次試驗(yàn),利用SPSS Statistics 22軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析,p<0.05為顯著性差異。采用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,圖表處理及圖譜分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆渣蛋白粒徑及ζ-電位分析

不同處理方式對豆渣蛋白粒徑分布、體積平均徑D[4,3]及ζ-電位的影響如圖1所示。與未處理?xiàng)l件相比，低溫超微粉碎處理蛋白粒徑降低至低至(24.06±0.02) μm，且ζ-電位絕對值增加至14.02±0.02，這是由于粒度降低導(dǎo)致蛋白比表面積增大，蛋白表面負(fù)電荷增加導(dǎo)致；與低溫粉碎條件對比發(fā)現(xiàn),常溫超微粉碎條件下豆渣蛋白溶液體積平均徑D[4,3]較高,ζ-電位絕對值低于低溫超微處理方式,表明低溫粉碎處理下豆渣蛋白溶液體系更加穩(wěn)定。原因可能是，在常溫粉碎條件下豆渣蛋白部分變性,蛋白結(jié)構(gòu)解折疊,熱聚集作用增強(qiáng),從而生成大尺度聚集體,粒徑增大,分子聚集作用增強(qiáng),故ζ-電位絕對值降低,體系穩(wěn)定性下降[25]。另外,在低溫超微處理?xiàng)l件下,隨著粉碎程度的不斷增加,豆渣蛋白粒徑先降低后升高，且ζ-電位絕對值呈先增加后降低的變化趨勢,表明高速剪切力使得豆渣蛋白粒徑不斷減小,故ζ-電位絕對值增加;但粉碎程度超過200目后，ζ-電位絕對值降低且粒徑增加,說明隨著粉碎程度進(jìn)一步加深,分子碰撞作用不再增加,過高剪切力作用使蛋白部分變性,粒子間極易相互吸引而發(fā)生聚集,體系穩(wěn)定性下降。

圖1 處理方式對豆渣蛋白粒徑分布、體積平均徑D[4,3]及ζ-電位的影響Fig.1 Effect of different treatments on particle size distribution,volume mean diameter D[4,3]and zeta potential of soy dregs protein

2.2 豆渣蛋白界面性質(zhì)分析

本研究測定不同處理?xiàng)l件下，豆渣蛋白的界面性質(zhì)—起泡性(FC)、起泡穩(wěn)定性(FS)、乳化活性(EA)和乳化穩(wěn)定指數(shù)(ESI)。如圖2所示,常溫超微粉碎條件下豆渣蛋白界面性質(zhì)不佳,原因可能是，常溫粉碎條件下,高速剪切作用過程會產(chǎn)生巨大沖擊力,從而對豆渣蛋白產(chǎn)生高溫、高壓作用,蛋白部分變性,蛋白分子間相互作用形成更多蛋白質(zhì)聚集體,因此乳化性和起泡性相對較差[26]。此外,在低溫粉碎條件下,隨著粉碎目數(shù)的增加,豆渣蛋白乳化性及起泡性均呈現(xiàn)先上升后降低的變化趨勢,這可能是由于，隨著粉碎目數(shù)的不斷增加,剪切力作用增強(qiáng),分子間碰撞作用增強(qiáng),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受到破壞，從而肽鏈得到進(jìn)一步伸展,使包埋于蛋白內(nèi)部的疏水性殘基暴露,增加多肽鏈的交聯(lián),使它們進(jìn)入油水界面,促使界面張力進(jìn)一步降低,分子中所帶的凈電荷數(shù)量增加,通過分子間靜電斥力阻止油滴聚合,從而提高了蛋白質(zhì)在界面的吸附能力,表現(xiàn)為較高的乳化能力[27];當(dāng)粉碎目數(shù)達(dá)到200目時,由于剪切力過高，使分子間碰撞作用停止,表面疏水性強(qiáng),乳膠無法達(dá)到良好的親水-疏水平衡。同時,Lee和Xiong等[28-29]研究表明,精磨粉碎處理后，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)β-折疊構(gòu)象的增加和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)減少,表明精磨粉碎后形成了更多的聚合和穩(wěn)定的谷蛋白網(wǎng)絡(luò),證明超微粉碎能夠使豆渣蛋白更趨向于有序結(jié)構(gòu),從而驗(yàn)證本研究中豆渣蛋白界面性質(zhì)的這種變化趨勢。

圖2 不同處理方式對豆渣蛋白界面性質(zhì)影響Fig.2 Effect of different treatments on interfacial properties of soy dregs protein

2.3 豆渣蛋白溶解性分析

不同處理方式下豆渣蛋白的溶解度變化如圖3所示。與未處理組相比,常溫及低溫超微粉碎均表現(xiàn)出良好的界面性質(zhì),另外,對比發(fā)現(xiàn)在同一蛋白濃度下，低溫超微粉碎處理后豆渣蛋白溶解度明顯增高,并隨著低溫粉碎程度的加深,溶解度呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢。產(chǎn)生這種變化的原因是，超微粉碎過程中產(chǎn)生分子碰撞及高速剪切作用,豆渣蛋白表面電荷增加,促進(jìn)蛋白溶解[2];同時,豆渣蛋白粒徑減小,蛋白顆粒比表面積增加,利于蛋白與水的結(jié)合;但隨著粉碎程度進(jìn)一步加深,分子碰撞作用不再增加,過高剪切力作用使蛋白部分變性,豆渣蛋白可能通過氫鍵及二硫鍵作用發(fā)生聚合,形成不溶性的蛋白聚集體,從而使得蛋白質(zhì)溶解度降低。另外,同一蛋白濃度下,常溫超微粉碎蛋白溶解度低于低溫處理方式,這可能是由于熱處理使得豆渣蛋白中的7S和11S成分部分變性,蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊,蛋白分子內(nèi)輸水性氨基酸暴露,導(dǎo)致分子間作用力下降,形成了不可溶性熱聚集體[25]。隨著蛋白濃度的增加,蛋白溶解度有所下降,這可能是由于，隨著豆渣蛋白濃度的增加，蛋白質(zhì)分子間的相互作用增強(qiáng)。

圖3 不同處理方式對豆渣蛋白溶液溶解度的影響Fig.3 Effect of different treatments on the solubility of soy dregs protein

2.4 豆渣蛋白二維熒光光譜分析

從圖4可以看出,常溫超微粉碎處理下豆渣蛋白熒光強(qiáng)度明顯降低,說明常溫粉碎過程中分子碰撞對豆渣蛋白造成一定的溫度效應(yīng),溫度升高使部分蛋白變性,從而使蛋白的內(nèi)源熒光產(chǎn)生猝滅作用,導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。研究表明，大豆蛋白的熒光主要來自于Trp殘基,且其熒光變化值可直接反應(yīng)大豆蛋白中Trp殘基本身及其周圍環(huán)境變化[30]。當(dāng)λmax大于330 nm時,表明Trp殘基位于蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境中[31],由此可知，本研究所測豆渣蛋白Trp殘基分布趨向于蛋白分子外部環(huán)境。

圖4 不同處理?xiàng)l件下豆渣蛋白的熒光光譜Fig.4 The fluorescence quenching of soy dregs protein under different treatment

低溫超微粉碎處理(100、200、300目)的豆渣蛋白的λmax分別為344.6、345.8及343.6 nm,與未處理組比較可知,低溫超微粉碎處理下豆渣蛋白發(fā)生紅移,隨著粉碎程度加深，紅移遷移量先增加后降低,并伴隨熒光強(qiáng)度的增大,表明低溫超微處理下豆渣蛋白Trp和Tyr的微環(huán)境發(fā)生改變,肽鏈結(jié)構(gòu)舒展[31]。Re?ek Jambrak[32]和Li等[33]認(rèn)為，在高速剪切作用過程中,空化氣泡的快速形成和塌陷,將產(chǎn)生高度湍流條件、極高的壓力和溫度,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)通過水解解折疊。而粉碎程度過大,豆渣蛋白分子間碰撞作用停止,氫鍵作用增大,分子間作用增強(qiáng),豆渣蛋白熒光強(qiáng)度均降低,表明豆渣蛋白之間存在交互作用。

2.5 豆渣蛋白三維熒光光譜分析

三維熒光可以精確解析蛋白的結(jié)構(gòu)信息[24]。如圖5所示為不同處理?xiàng)l件下豆渣蛋白的三維熒光光譜圖,并繪制相應(yīng)的強(qiáng)度等高線圖。其中Peak a(λex=λem)、Peak b(2λex=λem)分別為瑞利一級散射峰、二級散射峰;Peak 1為蛋白質(zhì)Trp和Tyr殘基的特征峰(λex=280 nm,λem=340 nm);此外Peak 2主要代表多肽鏈骨架結(jié)構(gòu)的特征峰(λex=230 nm,λem=350 nm),這些都是熒光峰的典型特征峰[34]。

圖5 豆渣蛋白體系三維熒光等高線圖Fig.5 The 3D-dimensional fluorescence line figure of soy dregs protein

由圖5可知,低溫超微粉碎條件下豆渣蛋白的Peak a相對熒光強(qiáng)度高于其他處理方式,隨著低溫粉碎程度的不斷加深,蛋白熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。研究指出,與未處理相比,常溫及低溫超微粉碎產(chǎn)生的高剪切作用使得蛋白粒徑減小,比表面積增加,豆渣蛋白聚合程度增強(qiáng),導(dǎo)致瑞利光散射作用增強(qiáng),從而使得這兩個散射峰的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)[35]。高速剪切作用過程中對豆渣蛋白存在溫度效應(yīng),溫度升高使部分豆渣蛋白變性,蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊,導(dǎo)致分子間作用力下降,故常溫粉碎下豆渣蛋白Peak a峰處熒光強(qiáng)度低于低溫處理?xiàng)l件。而對比低溫超微粉碎100、200、300目可知,隨著低溫超微目數(shù)的增加豆渣蛋白的瑞利衍射峰a相對熒光強(qiáng)度均有提高,這可能是由于，分子碰撞作用增強(qiáng)使得豆渣蛋白形成部分大粒徑的可溶性蛋白聚集體,增強(qiáng)光散射效果,表現(xiàn)出更強(qiáng)的瑞利衍射峰[36]。當(dāng)粉碎目數(shù)達(dá)到200目后,這種分子碰撞停止,故粉碎程度繼續(xù)加深，熒光強(qiáng)度反而下降。粉碎目數(shù)100、200、300目低溫超微粉碎處理下豆渣蛋白的熒光特征峰1強(qiáng)度分別為853.6、905.0、900.5,由此可知,隨著豆渣蛋白分子間碰撞作用增強(qiáng),分子間的相互作用逐漸減弱,氫鍵作用逐漸減小,故熒光強(qiáng)度呈上升趨勢變化;而當(dāng)粉碎程度達(dá)到200目時,豆渣蛋白分子間碰撞作用停止,粉碎程度繼續(xù)增加使得部分豆渣蛋白變性,蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊,分子內(nèi)疏水性氨基酸暴露。另發(fā)現(xiàn)，常溫超微粉碎處理對豆渣蛋白交互作用的促進(jìn)作用強(qiáng)于低溫超微粉碎處理,這與高速剪切作用過程中對豆渣蛋白的溫度效應(yīng)有關(guān)。

此外,未處理下豆渣蛋白熒光特征峰2熒光強(qiáng)度為380.5,在常溫及200目低溫超微粉碎處理下豆渣蛋白特征峰2熒光強(qiáng)度分別提高至626.5、603.2。這是由于高剪切力處理下的豆渣蛋白疏水基團(tuán)逐漸暴露所致。而低溫超微粉碎作用下，豆渣蛋白特征峰2熒光強(qiáng)度均有所降低,表明豆渣蛋白分子間作用降低，促使“暴露”態(tài)疏水性氨基酸重新包埋在分子內(nèi)部。

3 結(jié)論

本研究對比未處理、常溫超微粉碎及低溫超微粉碎(100、200、300目)下豆渣蛋白樣品的粒徑分布、體積平均粒徑D[4,3]、ζ-電位絕對值、界面性質(zhì)及溶解性等功能性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，在低溫粉碎200目下，豆渣蛋白性質(zhì)最佳;基于二維熒光光譜紅移現(xiàn)象結(jié)合三維熒光特征峰強(qiáng)度變化證明，低溫超微粉碎使豆渣蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊,蛋白分子內(nèi)疏水性氨基酸暴露,另外,高速剪切過程中的分子碰撞作用及溫度效應(yīng)變化有效支撐不同處理?xiàng)l件下豆渣蛋白的功能性變化。