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        大孔樹脂純化紅樹莓籽黃酮及其體外結(jié)合膽酸鹽能力評價(jià)

        2018-12-10 01:33:16,,,*,,,,,,,*
        食品工業(yè)科技 2018年23期
        關(guān)鍵詞:樣液膽酸樹莓

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        (1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 2.大連中超食品有限公司,遼寧大連 116400; 3.遼寧新大地實(shí)業(yè)發(fā)展集團(tuán)有限公司,遼寧沈陽 110168)

        紅樹莓是薔薇科懸鉤子屬植物,鮮果酸爽多汁,營養(yǎng)豐富,具有多種保健功效,被世界糧農(nóng)組織譽(yù)為第三代“黃金水果”[1-2]。紅樹莓加工產(chǎn)生的副產(chǎn)物紅樹莓籽常被丟棄,未得到充分利用。紅樹莓鮮果約含10%紅樹莓籽,若將其所含黃酮類化合物加以利用,不僅能夠變廢為寶,而且可以提高紅樹莓附加值[3-4]。黃酮類化合物具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂及抑菌消炎等生理活性[5-6]。

        黃酮類化合物純化方法主要有溶劑萃取法、膜分離法及樹脂法等[7],大孔樹脂具有選擇性好、吸附量大、吸附速度快及純化效果好等優(yōu)點(diǎn),廣泛用于黃酮類化合物純化[8]。聶超等[9]采用大孔樹脂純化倫晚臍橙總黃酮,純化后純度達(dá)33.45%。唐巧玉等[10]利用大孔樹脂純化金橘果皮總黃酮,純化后的總黃酮純度達(dá)38.2%。目前,采用大孔樹脂對紅樹莓籽黃酮類化合物純化研究較少。

        高血脂癥即血液中膽固醇和脂肪的代謝或運(yùn)轉(zhuǎn)異常疾病,主要表現(xiàn)為甘油三酯、血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇含量高,而高密度脂蛋白膽固醇含量低[11]。高血脂能夠引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死及其它心血管病[12]。化學(xué)類藥物能夠有效治療高血脂癥,但都有一定毒副作用,因此天然降血脂活性物質(zhì)的開發(fā)必將成為研究熱點(diǎn)。膽固醇降解會(huì)產(chǎn)生膽汁酸鹽,黃酮類化合物能夠與膽酸鹽結(jié)合,降低膽汁酸的重吸收率,促進(jìn)肝臟或血液中的膽固醇降解,生成更多膽酸鹽,從而降低血液中膽固醇含量[13]。胡凱等[14]通過構(gòu)建體外模型,比較不同茶浸提液對膽酸鹽的結(jié)合能力影響,結(jié)果表明茶葉中的功能性成分有降血脂功效。體外消化模型不僅重現(xiàn)性好,且簡單易操作,因此本文通過構(gòu)建體外消化模型來考察黃酮的降血脂功效。

        本研究通過大孔樹脂對紅樹莓籽黃酮進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附及解析試驗(yàn),確定紅樹莓黃酮純化最佳條件,為大孔樹脂純化紅樹莓籽黃酮應(yīng)用提供理論依據(jù);其次,以紅樹莓籽黃酮對膽酸鹽結(jié)合率為指標(biāo),進(jìn)行紅樹莓籽體外降血脂能力評價(jià),為開發(fā)天然降血脂藥物提供理論依據(jù),同時(shí)也為紅樹莓籽開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        紅樹莓籽 大連中超食品有限公司;AB-8大孔樹脂 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;鹽酸、亞硝酸鈉、檸檬酸、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇 分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司;?;悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉 上海金穗生物科技有限公司。

        ALPHA1-2 LD plus冷凍干燥機(jī) 北京奧創(chuàng)興業(yè)有限公司;UV2700紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;XZ-1真空泵 上海西利嘉真空設(shè)備制造有限公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 紅樹莓籽黃酮提取 按照實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化條件進(jìn)行提取,取一定量60目紅樹莓籽粉,以料液比1∶10 g/mL加入石油醚,在40 ℃下浸泡4 h,抽濾后取粉,40 ℃干燥2 h,按1∶30 g/mL加入80%乙醇,在50 ℃下水浴提取2 h,所得提取液在55 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀,并于冷凝溫度-54 ℃,真空度20 Pa下真空冷凍干燥24 h,制得紅樹莓籽粗黃酮粉,備用。

        1.2.2 紅樹莓籽黃酮濃度的測定 參照谷楠楠[15]的方法顯色,蘆丁標(biāo)曲Y=7.75X+0.047,R2=0.9996,計(jì)算黃酮濃度。

        1.2.3 AB-8大孔樹脂純化紅樹莓籽黃酮

        1.2.3.1 大孔樹脂預(yù)處理 取一定量AB-8大孔樹脂在95%乙醇中浸泡24 h,充分溶脹后用去離子水沖洗至無味,再經(jīng)4%鹽酸浸泡12 h,蒸餾水洗至中性,再經(jīng)5 mg/mL氫氧化鈉浸泡12 h,蒸餾水洗至中性,45 ℃干燥備用[16]。

        1.2.3.2 上樣量對紅樹莓籽黃酮吸附效果影響 取1.2.3.1中AB-8樹脂20 g濕法上柱,稱取一定量1.2.1中粗黃酮粉用去離子水溶解制成10 mg/mL樣液;調(diào)節(jié)pH至4.5、總上樣量150 mL、以1.5 mL/min上樣,流出液每10 mL收集一管,前10 mL棄去,按1.2.2中方法測定黃酮濃度,當(dāng)管內(nèi)黃酮含量為初始黃酮濃度1/10時(shí)視作泄漏[17]。

        1.2.3.3 上樣pH對紅樹莓籽黃酮吸附效果的影響 取1.2.3.1中AB-8樹脂20 g濕法上柱,稱取一定量1.2.1中粗黃酮粉去離子水溶解制成10 mg/mL樣液,上樣量150 mL,調(diào)節(jié)樣液pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5,以1.5 mL/min上樣,收集流出液,按1.2.2中方法測定黃酮濃度,計(jì)算吸附率,吸附率計(jì)算公式如下[18]:

        式中:C0-上樣液黃酮濃度,mg/mL;V0-上樣液體積,mL;C1-流出液黃酮濃度,mg/mL;V1-流出液體積,mL。

        1.2.3.4 上樣流速對紅樹莓籽黃酮吸附效果的影響 取1.2.3.1中AB-8樹脂20 g濕法上柱,稱取1.2.1中粗黃酮粉,用去離子水溶解制成10 mg/mL樣液,取100 mL樣液,調(diào)節(jié)pH至4.5,上樣流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min,收集流出液,按1.2.2中方法測定黃酮濃度,計(jì)算其吸附率。

        1.2.3.5 洗脫劑用量對紅樹莓籽黃酮解吸效果的影響 稱取1.2.1中粗黃酮粉,用去離子水溶解制成10 mg/mL樣液,取100 mL樣液,調(diào)節(jié)pH至4.5,以1.5 mL/min流速上樣,吸附完全后,用去離子水洗至流出液無色,量取200 mL的80%乙醇以1.5 mL/min流速洗脫,流出液每10 mL收集一管,前10 mL棄去,按1.2.2中方法測定黃酮濃度,繪制洗脫曲線。

        1.2.3.6 洗脫劑濃度對紅樹莓籽黃酮解吸效果的影響 稱取1.2.1中粗黃酮粉,用去離子水溶解制成10 mg/mL樣液,取100 mL樣液,調(diào)節(jié)pH至4.5,以1.5 mL/min流速上樣,吸附完全后,用去離子水洗至流出液無色,量取150 mL的濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇,以1.5 mL/min的流速洗脫,收集流出液,前10 mL棄去,按1.2.2中方法測定黃酮濃度,計(jì)算解吸率,解吸率計(jì)算公式如下[19]:

        式中:C0-上樣液黃酮濃度,mg/mL;C1-吸附后流出液黃酮濃度,mg/mL;C2-解吸后流出液黃酮濃度,mg/mL;V1-上樣液體積,mL;V2-洗脫液體積,mL。

        1.2.3.7 洗脫流速對紅樹莓籽黃酮解吸效果的影響 以最佳吸附條件上樣吸附完全后,用去離子水洗至流出液無色,量取150 mL濃度為70%的乙醇,分別0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min的流速洗脫,收集流出液,前10 mL棄去,按1.2.2中方法測定黃酮濃度,計(jì)算解吸率。

        1.2.3.8 AB-8大孔樹脂純化驗(yàn)證試驗(yàn) 依據(jù)試驗(yàn)得到最佳條件純化紅樹莓籽黃酮,將純化后的黃酮液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀,并置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥24 h,取一定量用60%乙醇溶解,測定黃酮濃度,計(jì)算純度,純度計(jì)算公式如下[20]:

        式中:C-黃酮濃度,mg/mL;V-樣液體積,mL;m-黃酮干粉質(zhì)量,mg。

        1.2.4 紅樹莓籽黃酮體外結(jié)合膽酸鹽能力的測定

        1.2.4.1 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線 稱取一定量膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和?;悄懰徕c,用磷酸緩沖溶液(pH6.3)溶解并配制成0.3 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液;分別取上述溶液0.0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于試管中,加磷酸緩沖溶液補(bǔ)齊至2.5 mL,再加入7.5 mL 60%硫酸,搖勻后于70 ℃水浴20 min,取出后冰浴5 min,在387 nm測吸光度。以膽酸鹽濃度為橫坐標(biāo),樣液吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[21]。

        1.2.4.2 膽酸鹽含量及結(jié)合率測定方法 取3組樣品分別加入4 mL?;悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、膽酸鹽溶液,37 ℃水浴恒溫振蕩1 h后,在8000 r/min條件下離心10 min。取2.5 mL上清液按1.2.4.1法顯色,以緩沖液代替樣品作為空白,測定吸光度值計(jì)算膽酸鹽含量樣品[22]。結(jié)合率計(jì)算公式如下:

        式中:C0-為空白組中膽酸鹽含量,mmol/mL;C1-樣品中膽酸鹽含量,mmol/mL。

        1.2.4.3 不同提取及純化方式黃酮制備 a. 醇提紅樹莓籽黃酮:參照本實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化條件,取一定量60目紅樹莓籽粉,按1∶30 g/mL加入80%乙醇,50 ℃提取2 h,所得提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀,置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥24 h,制得紅樹莓籽粗黃酮粉備用。

        b. 纖維素酶輔助提取黃酮:參照本實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化條件,取一定量60目紅樹莓籽粉按1∶40 g/mL加入60%乙醇,纖維素酶加入量0.01 mg/mL,pH5.5,提取溫度55 ℃下提取40 min,其余操作同醇提黃酮。

        c. 超聲波輔助提取紅樹莓籽黃酮:參照本實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化條件,取一定量60目紅樹莓籽粉按1∶30 g/mL加入60%乙醇,在50 ℃超聲功率175 W條件下提取50 min,其余操作同醇提黃酮。

        d. AB-8大孔樹脂純化紅樹莓籽黃酮:按上述1.2.3中最佳條件吸附并解吸,收集解吸液并將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),其余操作同醇提黃酮。

        1.2.4.4 不同提取方式黃酮對膽酸鹽結(jié)合能力影響 稱取1.2.4.3中4種樹莓籽黃酮各0.25 g,參照李俶[23]等的方法進(jìn)行體外胃消化2.5 h,以胃消化2.5 h作為腸消化的0 h,按閔芳芳等[24]的方法進(jìn)行體外腸消化2.5 h,取經(jīng)體外胃腸道消化后的樣液,在8000 r/min條件下離心10 min,取上清液2.5 mL,按1.2.2.2方法測定膽酸鹽含量,計(jì)算結(jié)合率。

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        上述試驗(yàn)每組均重復(fù)3次,單因素取平均值作圖,采用office辦公軟件作圖,IBM SPAS Statistics 22.0軟件進(jìn)行方差分析;利用Design-Expert 8.0.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析。顯著水平0.05。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 大孔樹脂純化紅樹莓籽黃酮工藝

        2.1.1 上樣量對紅樹莓籽黃酮吸附效果的影響 上樣量是影響樹脂吸附效果的重要因素,上樣量少,樹脂不能吸附飽和,產(chǎn)率低;上樣量大,樹脂吸附飽和后無法繼續(xù)吸附,樣液直接流出[25]。如圖1所示,隨著收集的流份增加,紅樹莓籽黃酮濃度逐漸增大,當(dāng)收集到第10管時(shí),黃酮濃度達(dá)到初始濃度的1/10,樹脂達(dá)到了泄漏點(diǎn),當(dāng)超過10管后黃酮濃度迅速增大,可能是樹脂吸附量已達(dá)到飽和。因此,為避免黃酮樣液浪費(fèi),選取100 mL為紅樹莓籽黃酮最佳上樣量。

        圖1 泄漏曲線Fig.1 The curve of adsorption leakage

        2.1.2 上樣pH對紅樹莓籽黃酮吸附率的影響 pH能夠影響黃酮的電離程度,改變其存在形式和溶解度,進(jìn)而影響黃酮類化合物與大孔樹脂間作用力,從而影響大孔樹脂對黃酮類化合物的吸附效果[26]。如圖2可知,隨著pH升高,紅樹莓籽黃酮吸附率逐漸增加,當(dāng)pH達(dá)到4.5時(shí),吸附率達(dá)到最大,而后吸附率開始緩慢降低。因此選擇4.5為最佳上樣pH。

        圖2 上樣pH對紅樹莓籽黃酮吸附率影響Fig.2 Effect of sample pH on the adsorption of flavonoids注:圖中不同字母表示梯度間存在顯著性差異(p<0.05),圖3、圖5~圖7同。

        2.1.3 上樣流速對紅樹莓籽黃酮吸附率的影響 上樣流速對樹脂吸附效果有明顯影響,上樣流速過快,樣液與樹脂接觸時(shí)間短,吸附效果不好,上樣流速過慢則吸附時(shí)間延長,效率降低,試驗(yàn)周期長[27]。由圖3可知,隨著上樣流速的增加其吸附率逐漸降低,當(dāng)流速超過1.5 mL/min時(shí),吸附率顯著降低(p<0.05),考慮到試驗(yàn)周期及生產(chǎn)效率,因此選擇1.5 mL/min為最佳上樣流速。

        圖3 上樣流速對紅樹莓籽黃酮吸附率影響Fig.3 Effect of flow rate on the adsorption of flavonoids

        2.1.4 洗脫劑用量對紅樹莓籽黃酮洗脫效果的影響 由圖4可知,隨著洗脫劑用量增加,洗脫出的黃酮濃度顯著升高,當(dāng)洗脫體積為60 mL時(shí),黃酮濃度達(dá)到最大值。超過60 mL后再繼續(xù)增加洗脫劑用量,黃酮濃度逐漸降低,當(dāng)洗脫劑用量增至150 mL時(shí),黃酮濃度幾乎為0,因而選取150 mL為最佳洗脫劑用量。

        圖4 AB-8大孔樹脂洗脫曲線Fig.4 Desorption curve of AB-8 resin

        2.1.5 乙醇濃度對紅樹莓籽黃酮解吸率影響 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對紅樹莓籽黃酮解吸率影響如圖5所示。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加,解吸率明顯上升,當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí),解吸率達(dá)到最高,為80.7%,乙醇濃度超過60%時(shí),解吸率迅速降低,這可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)過大,解吸出的雜質(zhì)也隨之增加,使得解吸率降低[18]。因此確定60%乙醇為最佳洗脫濃度。

        圖5 乙醇濃度對紅樹莓籽黃酮解吸率影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the desorption rate

        2.1.6 洗脫流速對紅樹莓籽黃酮解吸率影響 由圖6可知,當(dāng)流速在0.5~1.5 mL/min范圍內(nèi),解吸率緩慢降低,洗脫流速為1.5 mL/min時(shí),解吸率為89.3%,而后隨著洗脫流速的增加,解吸率迅速降低。洗脫流速過慢,試驗(yàn)循環(huán)周期相應(yīng)延長,流速過快,會(huì)導(dǎo)致洗脫劑與大孔樹脂不充分,紅樹莓籽黃酮不能完全被洗脫下來。為提高純化效率,選擇1.5 mL/min為最佳洗脫流速。

        圖6 洗脫流速對紅樹莓籽黃酮解吸率影響Fig.6 Effect of ethanol flow rate on the desorption rate

        2.1.7 紅樹莓籽黃酮純化工藝驗(yàn)證 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,采用最佳吸附解吸條件重復(fù)3次進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),得到樹脂的平均吸附率為84.04%,解吸率為91.23%,將所得洗脫液濃縮、凍干后,得到純化的黃酮粉末,純度由原來的25.07%提高至48.19%,產(chǎn)品純度提高了23.12%,說明該工藝條件穩(wěn)定可行,可有效提升紅樹莓籽黃酮純度。

        2.2 紅樹莓籽黃酮體外結(jié)合膽酸鹽效果評價(jià)

        2.2.1 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線 ?;悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉的回歸方程依次為:y=14.473x+0.0407,R2=0.9995;y=11.41x+0.0075,R2=0.9995;y=23.168x+0.036,R2=0.9993。3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,可計(jì)算膽酸鹽濃度。

        2.2.2 不同提取方式黃酮粉結(jié)合膽酸鹽效果評價(jià) 不同方式提取的紅樹莓籽黃酮凍干粉與?;悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉3種膽酸鹽的結(jié)合能力如圖7所示。3種提取法及純化黃酮對3種膽酸鹽結(jié)合能力最強(qiáng)的均是AB-8純化黃酮,AB-8純化黃酮對牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和膽酸鈉結(jié)合率依次為79.35%、74.88%和74.56%。其中,AB-8純化黃酮和醇提黃酮對膽酸鈉結(jié)合率分別為74.56%和73.06%,差異不顯著(p>0.05),結(jié)合效果較好。從整體分析,AB-8純化黃酮對3種膽酸鹽結(jié)合能力較強(qiáng),其余依次為醇提、超聲波和酶提黃酮。

        圖7 紅樹莓籽黃酮粉對膽酸鹽吸附率的影響Fig.7 The effect of flavonoids on the adsorption rate of cholate salt

        3 結(jié)論

        通過AB-8大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附及解吸試驗(yàn),確定純化紅樹莓籽黃酮最佳條件:在pH4.5、流速1.5 mL/min條件下上樣100 mL;以60%乙醇為洗脫劑,在流速1.5 mL/min下洗脫150 mL,紅樹莓籽黃酮純度由25.07%升高到48.19%,提高了23.12%,說明AB-8大孔樹脂適用于紅樹莓籽黃酮的純化,可為后續(xù)黃酮單體分離提供參考。

        AB-8純化黃酮對牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和膽酸鈉結(jié)合率依次為79.35%、74.88%和74.56%,說明結(jié)合能力較強(qiáng),其余依次為醇提、超聲波和酶提黃酮,由此表明,紅樹莓籽黃酮對膽酸鹽結(jié)合能力良好,且結(jié)合效果最好的是經(jīng)AB-8純化的黃酮,可為開發(fā)天然降血脂藥物提供理論依據(jù)。

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