牛琛皓 高霞

【摘 要】 Alport綜合征（Alport syndrome，AS）是一種遺傳性腎病， 是由編碼α3、α4、α5（IV）膠原三聚體的COL4A3，COL4A4或COL4A5基因突變引起的。AS目前仍缺乏有效的治療措施，故對AS早期確診、治療、延緩進展以及提供AS家系遺傳學分析，減少遺傳風險意義重大。隨著二代測序技術的成熟與廣泛應用，為尚未發(fā)現熱點突變的AS患者基因測序及診斷提供了新方法。同時針對罕見病，建立生物樣本庫也是未來罕見病研究發(fā)展趨勢。本文將重點介紹二代測序技術近年來在AS應用及診斷中的進展情況。

【關鍵詞】 Alport綜合征；COL4A3；COL4A4；COL4A5；二代測序技術；生物樣本庫

【中圖分類號】

R969.4 【文獻標志碼】

A 【文章編號】1005-0019（2018）21-292-02

1 引言

Alport綜合征（Alport syndrome，AS）是一種進行性的遺傳性腎小球疾病，表現為鏡下血尿或肉眼血尿，可伴有蛋白尿，聽力及視力下降，可進展至終末期腎病[1]，其發(fā)病率約為1/5000，在導致兒童慢性腎功能衰竭的病因中約占3.0%[3]。

AS是由編碼α3、α4、α5（IV）膠原異源三聚體的COL4A3，COL4A4或COL4A5基因突變引起的遺傳性疾病，其中α3、α4 基因突變所致為常染色體顯性或隱性遺傳，α5鏈基因突變所致為X染色體連鎖的顯性遺傳[4-5]。COL4An（n為3、4或5）突變形式多種多樣，尚未發(fā)現熱點突變。目前報道顯示突變類型以點突變，小的缺失最為常見，其他的有插入、重排等[6-7]。通過免疫熒光檢查突變所致的Ⅳ型膠原鏈的異?？梢栽\斷AS，但部分突變形成的異常Ⅳ型膠原鏈免疫熒光無法顯示，此時就要從基因診斷方面研究。第二代測序（next-generation sequencing， NGS）技術的發(fā)展與成熟，為AS的基因診斷及AS患者基因突變篩查提供了新的方法。

2 AS目前的診斷方法（體系）

20世紀80年代，診斷AS多采用Flinter等提出的“四項診斷指標”，簡便，但不能做到確診，更沒有遺傳學提示。之后Gregory等提出AS診斷十條標準，全面但十分繁瑣。再到目前的診斷方法：（1）腎活檢電鏡檢查可見GBM出 現特異性的超微病理病變；（2）皮膚基底膜（IV）鏈表達異常，有些情況下還要結合腎組織基膜僅（IV）鏈的表達；（3）COL4An基因突變。

3 NGS技術特點及在AS中的應用價值

NGS技術特點：（1）高通量。可對芯片上數百萬個點同時測序；（2）成本低。

NGS技術每Mb堿基成本比Sanger測序顯著降低；（3）敏感性高，能保證對低豐度DNA信息的檢測。

AS致病基因COL4A5（51個外顯子）、COL4A3（52個外顯子）和COL4A4（48個外顯子），未發(fā)現突變熱點，采用傳統PCR方法測序費時費力成本高昂。提取患者皮膚標本培養(yǎng)成纖維細胞應用RT—RCR測序方法來檢測COL4A5基因在某些無義突變介導的mRNA降解或外顯子大片段缺失等情況下可導致突變檢測失敗。

而NGS技術可在同一張芯片上高特異性和高覆蓋率捕獲研究者感興趣的目標外顯子區(qū)域，從而篩選出突變。

4 目前報道的運用二代測序技術發(fā)現的突變位點

2017年一西班牙AS家系中，研究者應用NGS技術發(fā)現新發(fā)突變COL4A3基因外顯子18中的p.G333E，外顯子48中的Pro-Leu置換（p.P1461L），外顯子49中的Ser-Cys替代（p.S1492C），以及COL4A3基因中p.G333E和p.P1461L或p.S1492C突變的攜帶者比僅攜帶p.G333E突變的攜帶者臨床癥狀更加嚴重，發(fā)病更早。2017年中國一AS家系報道中發(fā)現COL4A5突變類型中無義突變和甘氨酸替代比其他錯義突變臨床表現更嚴重，COL4A5中由酸性氨基酸取代甘氨酸引起的臨床表型更為嚴重。同年，意大利一AS家系報道中，研究者應用NGS技術發(fā)現發(fā)現c.2245-40A>G等位基因的X染色體滅活與雜合子女性中的疾病嚴重程度相關。使用常用生物信息分析軟件結果趨向于雜合A→G這種氨基酸置換具有有害性。2016年研究人員在希臘家族性微血管畸形的研究中發(fā)現患有COL4A3/A4基因雜合突變的患者可能會被誤診為FSGS（局灶性節(jié)段性腎小球硬化）。發(fā)現新發(fā)突變COL4A5-p.C1567R，以及突變COL4A4-p.G748S，COL4A4-p.G774R和p.G1465D在兩個不相關的家庭中具有普遍性。

5 利用NGS技術研究AS及慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）的潛力（建立AS及慢性腎臟病生物信息樣本庫）

生物樣本庫是一種應用于支持遺傳研究的結構化資源，共有2種類型：（1）人口生物樣本庫（population—based biobank）；（2）疾病生物樣本庫（disease—oriented biobank）；建立CKD及AS患者生物信息樣本庫，可獲得大量生物信息，加以處理分析得出生物信息學數據可運用在疾病的干預與管理。運用NGS技術可有針對性的選取所要研究的遺傳性疾病的生物信息，快速建立對應疾病的生物信息樣本庫。

結語

AS是進行性、終生性的，盡早確診有利于AS患者及家族成員得到有針對性的干預和治療。NGS技術運用于AS的基因診斷是很有意義的，并且可便于區(qū)分TBMD（腎小球薄基底膜?。┗駻S，代表著未來AS的診斷方向。以NGS技術獲取大數據為基礎建立AS的生物信息樣本庫，將為今后AS的多領域研究提供數據支撐。

參考文獻

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