劉穎 劉鳳蘭

【摘 要】

目的：探討無添加的黑枸杞酵素面膜抗衰老活性及安全性評價。方法：通過DPPH自由基清除試驗、羥自由基清除試驗考察抗氧化性能、MTT法檢測成纖維細胞增殖、流式細胞術(shù)測定成纖維細胞凋亡率、家兔眼刺激試驗進行整體評價。結(jié)果：抗氧化實驗表明：黑枸杞酵素面膜具有很好的清除自由基作用，作用效果強于VE，且與劑量成正相關(guān)；細胞增殖實驗表明：黑枸杞酵素面膜對成纖維細胞具有很好的增殖作用；流式細胞儀檢測細胞凋亡率實驗表明，培養(yǎng)24 h 的皮膚成纖維細胞凋亡率明顯降低。結(jié)論：由酵素制備的黑枸杞無添加面膜可作為化妝品進行推廣和使用。

【關(guān)鍵詞】 黑枸杞；酵素；無添加；抗衰老

【中圖分類號】R285.5

【文獻標(biāo)志碼】A

【文章編號】1005-0019（2018）21-187-01

黑枸杞屬于茄科枸杞屬，生長環(huán)境使其具有極強的的耐寒、耐高溫、耐干旱力，古醫(yī)籍中具有益腎明目、補血寧神、生津止渴的功效，由于其含有豐富的微量元素、原花青素 、枸杞多糖 、甜菜堿、酸漿紅素、胡蘿卜素、維生素、亞油酸等，現(xiàn)代科學(xué)認為其可提高肌膚細胞抗氧化、抗衰老、保濕、抗過敏及抗炎等能力[1] 。是化妝品珍貴的原料之一。但在有限的工藝條件下，其提取出的護膚活性成分含量較低。而采用生物發(fā)酵技術(shù)，過程中基質(zhì)金屬蛋白酶的活性受到抑制，可降低其對膠原蛋白的裂解，從而能更好地保持黑枸杞的營養(yǎng)成分。

本試驗使用的即為采用生物發(fā)酵技術(shù)工藝制備的黑枸杞面膜，同時添加了具有抗衰老成分的銀耳、人參等成分，制備過程中堅守天然無添加的原則，從而既保證了有效成分高提取率，高吸收率，又可防止防腐劑對機體造成的內(nèi)分泌紊亂、神經(jīng)系統(tǒng)傷害及產(chǎn)生的皮膚的過敏等毒性作用。以期為現(xiàn)代所倡導(dǎo)的綠色高科技的無添加化妝品制備提供理論依據(jù)。

1 實驗材料和方法

1.1 供試品 洋媽制嫩膚葆顏水潤鮮膜，由廈門洋媽制生物科技有限公司制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗氧化試驗

1.2.1.1 DPPH自由基清除試驗 參考文獻[2]，稱取適量DPPH，用無水乙醇配制DPPH 溶液。將面膜液以85%的乙醇進行等比稀釋，稀釋后相當(dāng)于質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.6、3.2g/L的待測液，加入至96孔板中，另設(shè)空白對照組和維生素E陽性對照組，再加入 150 μL 濃度為 0.1 mmol/L 的 DPPH 溶液，混合均勻，避光反應(yīng) 30 min，517 nm 波長處，測定吸光度A 值，計算清除率。

1.2.1.2 羥基自由基清除試驗 將面膜提液以85%的乙醇進行等比稀釋，稀釋后相當(dāng)于質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0g/L的待測液，參照文獻[3]，在比色管中依次加入2.0 mL 9.0mmol/L的FeSO 4溶液、待測樣品和2.0 mL8.8mmol/L的過氧化氫溶液，混勻，靜置10 min，再加入 2.0 mL 6.0 mmol/L的水楊酸乙醇溶液，振蕩器上混勻，置于37℃水浴鍋中，20 min后，離心8min，取上清液測定吸光度（A536nm），所得值為A1；設(shè)蒸餾水空白組，測得吸光度為A0；陰性組吸光度記A2。羥基自由基清除率計算公式為：（A1-A0） /（A2-A0） ×100%。另設(shè)維生素E為陽性對照組進行測定。

1.2.2 成纖維細胞增殖實驗

1.2.2.1 細胞培養(yǎng) 組織塊貼壁法[4]體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞，用4-6代處于對數(shù)成長期細胞。

1.2.2.2 供試品處理 精密稱取面膜液（無添加和添加防腐劑）各1ml，相當(dāng)于含有原料藥為0.1克，臨用時用含80ml/L的PBS的DMEM倍比稀釋成不同濃度的面膜稀釋液。使成濃度為50μg /ml、100μg /ml、200μg /ml的三個劑量組。

1.2.2.3 實驗分組 分為7組：空白組；低、中、高供試品組；低、中、高加入防腐劑供試品組。

1.2.2.4 MTT法檢測體外培養(yǎng)成纖維細胞的增殖 取胰酶消化培養(yǎng)的細胞，調(diào)整細胞濃度，分別加入以上6個供試品溶液，置于96孔板，同時設(shè)不加藥物的空白對照組。每個質(zhì)量濃度及空白組設(shè)4個復(fù)孔，另做 1 孔不加細胞 ，只加培養(yǎng)液和中藥（比色時用此孔調(diào)零）。培養(yǎng) 24小時后取出，490nm下測定吸光值。

1.2.3 流式細胞儀檢測成纖維細胞凋亡率 細胞分為兩組，酵素面膜組，劑量為300μg /ml，另一組為相應(yīng)濃度的 DMSO（0. 01 %）作溶劑的對照組，將細胞接種于 6 孔板中，CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 家兔眼睛刺激試驗 取實驗動物兔4只，雌性，健康狀態(tài)下進行試驗，輕拉開單側(cè)眼下眼瞼，取供試品0.1ml滴入結(jié)膜囊中，分別觀察12、24、48、72、96h及第7天的眼部反應(yīng)，按照化妝品的安全性評價程序規(guī)定的評分標(biāo)準進行權(quán)重評級。

2 實驗結(jié)果

2.1 抗氧化實驗結(jié)果

2.1.1 黑枸杞酵素面膜對DPPH具有很好的清除作用，且作用效果強于VE，且與劑量成正相關(guān)，當(dāng)濃度達到3.2g/L時，清除率可達67.5%。結(jié)果見圖1。

2.1.2 由實驗結(jié)果可知，黑枸杞酵素面膜對羥自由基具有很好的清除作用，且作用效果強于VE，且與劑量成正相關(guān)，當(dāng)濃度達到8.0g/L時，清除率可達68.3%。結(jié)果見圖2。

2.2 MTT細胞增殖實驗結(jié)果 細胞增殖實驗表明，黑枸杞酵素面膜對成纖維細胞具有很好的增殖作用，與添加防腐劑的進行對比，其效果優(yōu)于添加劑組，結(jié)果見圖3。

2.3 流式細胞儀細胞凋亡試驗結(jié)果 通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率實驗 ，結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h 的皮膚成纖維細胞凋亡率明顯降低，已由 49.9%下降到26.3 %（P <0.01） ，結(jié)果見表1.

2.4 安全性試驗結(jié)果 家兔眼刺激試驗結(jié)果表明，受試家兔眼睛7天內(nèi)指標(biāo)均為正常。根據(jù)“國家食品藥品監(jiān)督管理局化妝品規(guī)定眼刺激性評價標(biāo)準”，評價結(jié)果為無刺激性。

3 討論

酵素含有豐富的酶，人體肌膚中的酵素能促進表皮細胞的新陳代謝，促進真皮纖維的再生，起到清潔皮膚，去除油脂消除青春痘，淡化皺紋，改善肌膚狀況，使皮膚緊實細致，年齡增長導(dǎo)致體內(nèi)酵素的減少，也是皮膚衰老的主要原因之一。因此將現(xiàn)代生物技術(shù)制備的酵素加入到美容產(chǎn)品中，可以起到加強肌膚的健康，延緩皮膚衰老的作用[5]，酵素已然成為一類新興的化妝品功效添加劑。

目前評價抗氧化的方法有ABST、DPPH試驗、超氧陰離子實驗、羥自由基實驗、脂質(zhì)過氧化抑制試驗、還原能力的測定[6]，其中DPPH是天然產(chǎn)物抗氧化能力最常使用的一種評價方法[7]；羥自由基由于可以使氨基酸、核酸等多種物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)[8]而成為活性很強的自由基，本實驗采用這兩種經(jīng)典方法對其抗氧化能力進行評定，試驗結(jié)果初步證明了其具有較強的抗氧化能力，且隨劑量增加而增加；成纖維細胞是皺紋形成過程中發(fā)揮主要作用的細胞，衰老的主要表現(xiàn)為：增殖能力降低和細胞凋亡率的明顯增加[9]，本試驗采用MTT和流式細胞術(shù)對這兩種指標(biāo)進行檢測，真實的反映了供試品對成纖維細胞的生物學(xué)特性改變，為本面膜的效果做出了有價值的評定，其中MTT法對無添加和有添加做了比較，無添加產(chǎn)品效果明顯好于添加產(chǎn)品，說明了化學(xué)類的防腐劑對細胞的增殖具有一定的抑制作用，在有效成分的配合使用下方顯出一定效果，間接證明了它對皮膚或機體具有一定的副作用，使用本產(chǎn)品的無添加形式具有一定的安全性優(yōu)勢，對于孕產(chǎn)婦婦女優(yōu)越性更是可觀，安全性評價符合嚴格的標(biāo)準化規(guī)定，如前所述，酵素不僅具有很好的抗衰老、改變皮膚狀況作用，而且對于處方中藥物成分的提取和促進皮膚的吸收以至于防腐都有一定的效果，其在國外已經(jīng)普及使用，但在我國還處于起步階段，隨著人們對化妝品綠色、安全、高科技的青睞，本實驗用化妝品具有廣闊的開發(fā)前景。

參考文獻

[1] 林麗，張裴斯，晉玲，等.黑果枸杞的研究進展[J].中國藥房，2013，24（17）：4493-4497.

[2] 孫麗萍，王大仟，張智武.11 種天然植物提取物對 DPPH 自由基的清除作用[J].食品科技，2009，30（1）：45 -47.

[3] Zhang Zuofa，Lv Guoying，He Weiqiang，et al.Effects of extractionmethods on the antioxidant activities of polysaccharides obtained from Flammulina velutipes [J].Carbohydrate Polymers，2013，98 （2）：1524-1531.

[4] 王林林，張健等.優(yōu)化貼壁法人皮膚成纖維細胞的原代培養(yǎng)[J]南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)版，2014，34（1）：124-126.

[5] 董銀卯，何聰芬，王領(lǐng)，等.火龍果酵素生物活性的初步研究[J].食品科技，2009（34）：192-196.

[6] 曾維才，石碧，天然產(chǎn)物抗氧化活性的常見評價方法[J]，化工進展，2013，32（6）：1205-1211

[7] Sharma O P，BhatPK，DPPH aotinxidant assay revisited[J]，food Chemistry，2009，113（4）：1202-1205.

[8] 郭雪峰，岳永德等.用清除羥自由基法評價竹葉提取物抗氧化能力[J].光譜學(xué)與光譜分析，2010，30（2）：508 -511.

[9] Gentile M，Latonen L，Laiho M，et al.Cell cycle arrest and ap Optosis provoked by UV radiation-induced DNA damage are transcriptionally highly divergent responses. Nucleic Acids Res，2003，31：4779-4790.