凌榮秀 樊郁蘭 劉 娜 解凱彬

（南京師范大學(xué)教師教育學(xué)院 江蘇南京 210024）

“制作泡菜并檢測(cè)亞硝酸鹽含量”是人教版高中生物學(xué)教材中的一個(gè)經(jīng)典選修實(shí)驗(yàn)。師生在該實(shí)驗(yàn)中，通常只測(cè)定亞硝酸鹽含量，但鮮少關(guān)注影響含量變化的因素，且對(duì)其中原理解釋不清晰，缺乏探究意識(shí)。泡菜中含有一定量的亞硝酸鹽，當(dāng)其含量超過(guò)一定的濃度范圍后，易與胺產(chǎn)生致癌物，對(duì)人體有嚴(yán)重的危害。研究表明，泡菜在發(fā)酵過(guò)程中，亞硝酸鹽含量呈先上升到達(dá)峰值再下降的趨勢(shì)［1］，且泡菜的發(fā)酵方式、溫度、食鹽濃度、泡菜液的pH等都會(huì)對(duì)其含量的變化產(chǎn)生影響［2］。食醋是常見的酸性食品調(diào)味劑，加酸處理后的泡菜亞硝峰生成水平顯著降低［3］。

本文通過(guò)研究在白蘿卜、白菜、豇豆3種泡菜中添加不同濃度的食醋后亞硝酸鹽含量的變化，為中學(xué)“制作泡菜并檢測(cè)亞硝酸鹽含量”的實(shí)驗(yàn)提供一種探究思路，提升學(xué)生理性思維和科學(xué)探究能力。此外，在響應(yīng)課程標(biāo)準(zhǔn)探究理念的同時(shí)，嘗試解釋食醋對(duì)不同種泡菜中亞硝酸鹽含量影響的原因，并為學(xué)生的實(shí)際生活提出合理建議。

1 實(shí)驗(yàn)原理

在酸化條件下，對(duì)氨基苯磺酸與亞硝酸鹽發(fā)生重氮反應(yīng)，生成的重氮鹽與N-1-萘基乙二胺耦合，生成玫瑰紅色染料（ADDBS），產(chǎn)物ADDBS的紫外吸收光譜在550 nm附近具有最大吸收值［4］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)配制不同濃度梯度的亞硝酸鹽溶液，顯色后在550 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行光電比色，測(cè)得OD值，運(yùn)用Excel軟件繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程，測(cè)出實(shí)驗(yàn)樣品的OD值后，利用關(guān)系式推算則可得出實(shí)驗(yàn)樣品中亞硝酸鹽含量。

2 材料與方法

2.1 材料 白蘿卜、豇豆、白菜、姜、干紅辣椒、食鹽、食醋（白醋）。

2.2 試劑 60%乙酸、20 g/L NaOH溶液、NH4Cl緩沖液（pH：9.6～9.7）、0.42 mol/L ZnSO4溶液、顯色液、NaNO2濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液。

1）顯色液的配制。

①對(duì)氨基苯磺酸溶液：取0.5 g對(duì)氨基苯磺酸，溶于35 mL蒸餾水和15 mL冰乙酸中混勻，置于棕色瓶中保存；

②N-1-萘基乙二胺溶液：取0.5 g N-1-萘基乙二胺，加入500 mL 60%乙酸溶液，混勻后置于棕色瓶放入冰箱中保存，1周內(nèi)保持穩(wěn)定；

初檢共獲得相關(guān)文獻(xiàn)333篇，經(jīng)逐層篩選，最終納入21個(gè)研究。文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果見圖1。納入研究的基本特征見表1。

③顯色液：將上述配制的2種溶液等體積混勻，遮光保存。

2）NaNO2濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液。

①5 μg/mL亞硝酸鈉溶液：稱取0.1 g NaNO2加蒸餾水定容至500 mL，從中吸取5 mL再加蒸餾水稀釋至200 mL，得到5 μg/mL NaNO2溶液；

②不同濃度梯度的NaNO2溶液的配制：用移液管吸取 0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 的 5 μg/mL NaNO2溶液分別置于25 mL 容量瓶中，編號(hào) 1～7 號(hào)（5 μg/mL×X=Y×25 mL，X指提取初始濃度的體積，Y指欲配制的特定濃度）。分別加入4.5 mL NH4Cl緩沖液、2.5 mL 60%乙酸和5mL顯色液，混勻，加蒸餾水定容至25 mL，在暗處?kù)o置25 min。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 將濃度為 0 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.6 μg/mL、0.8 μg/mL、1.0 μg/mL 的 NaNO2溶液， 分別倒入比色杯，放入分光光度計(jì)樣品室中，設(shè)置波長(zhǎng)為550 nm，通過(guò)0 μg/mL的樣品進(jìn)行校準(zhǔn)調(diào)零，拉動(dòng)滑桿，逐一測(cè)出樣品的OD值。

根據(jù)NaNO2的濃度與體積計(jì)算出NaNO2含量，得出NaNO2含量與相應(yīng)OD值數(shù)據(jù)表，見表1。運(yùn)用Excel軟件繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

表1 不同NaNO2含量對(duì)應(yīng)的OD值

圖1 OD值-亞硝酸鹽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 泡菜樣品中亞硝酸鹽含量測(cè)定

2）樣品測(cè)定。泡菜中亞硝酸鹽含量測(cè)定：①稱取5 g泡菜，研磨成勻漿，加入相應(yīng)泡菜液6 mL，混合均勻后進(jìn)行離心，取上清液于小燒杯中，滴加NaOH溶液，調(diào) pH至 8.0，再加入 5 mL ZnSO4，會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，若不產(chǎn)生則再滴加NaOH溶液，至產(chǎn)生白色沉淀為止。②將上述處理液放入60℃水浴鍋中水浴10 min，取出靜置，冷卻至室溫后過(guò)濾到100 mL容量瓶中定容并搖勻。③取10 mL樣品液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶，依次加入2.5 mL 60%的乙酸，4.5 mL NH4Cl緩沖液，5 mL現(xiàn)配顯色液，定容并搖勻，放入暗箱中靜置25 min。④測(cè)出樣品液OD值（注意設(shè)置空白組進(jìn)行校準(zhǔn)調(diào)零）。

3 結(jié)果與分析

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1）添加不同濃度食醋的泡白菜中亞硝酸鹽含量變化。圖2為泡白菜中亞硝酸鹽含量的變化。由圖可知：亞硝酸鹽含量第3天到達(dá)峰值；相較于對(duì)照組而言，食醋對(duì)泡白菜中亞硝酸鹽產(chǎn)生有抑制效果，添加食醋后泡白菜中亞硝峰均顯著降低；食醋濃度0.6%情況下，亞硝酸鹽含量普遍最低。

圖2 添加不同濃度食醋的泡白菜中亞硝酸鹽含量變化

2）添加不同濃度食醋的泡豇豆中亞硝酸鹽含量變化。圖3為泡豇豆中亞硝酸鹽含量的變化。由圖可知：亞硝酸鹽含量第3天到達(dá)峰值，峰值均小于2 mg/kg；泡豇豆中食醋組亞硝酸鹽含量普遍很低，添加食醋對(duì)其亞硝酸鹽的產(chǎn)生有抑制效果，其中1.2%食醋組抑制效果最明顯。

圖3 添加不同濃度食醋的泡豇豆中亞硝酸鹽含量變化

3）添加不同濃度食醋的泡蘿卜中亞硝酸鹽含量變化。圖4為泡蘿卜中亞硝酸鹽含量的變化。由圖可知：亞硝酸鹽含量第3天到達(dá)峰值，均低于對(duì)照組，其中0.9%食醋組峰值最低。

圖4 添加不同濃度食醋的泡蘿卜中亞硝酸鹽含量變化

總體對(duì)3種泡菜而言：亞硝酸鹽含量（泡白菜＞泡蘿卜＞泡豇豆）；亞硝酸鹽含量呈先上升后下降的趨勢(shì)；食醋對(duì)3種泡菜亞硝酸鹽產(chǎn)生均有抑制效果，但存在一定差異。

3.2 討論

1）3 種泡菜中亞硝酸鹽含量總體變化趨勢(shì)及原因。泡菜中亞硝酸鹽含量呈先上升后下降趨勢(shì)，與前人研究一致。蔬菜本身含有一定量的硝酸鹽和少量亞硝酸鹽，并且在種植過(guò)程中會(huì)殘留一些細(xì)菌。發(fā)酵初期，乳酸菌含量少，且大多數(shù)乳酸菌本身不帶有硝酸鹽還原酶和氨基酸脫羧酶，其代謝產(chǎn)物不會(huì)轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽。因此產(chǎn)生亞硝酸鹽的主要是蔬菜中所帶的雜菌，例如大腸桿菌、假單孢子菌等硝酸還原菌［5］。發(fā)酵前期的有氧環(huán)境有利于雜菌生長(zhǎng)，大量的硝酸鹽被雜菌還原成亞硝酸鹽，而蔬菜中的酚類物質(zhì)及維生素C能將生成的亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽。但整體來(lái)說(shuō)，單位時(shí)間內(nèi)生成的亞硝酸鹽大于被氧化的亞硝酸鹽，因此亞硝酸鹽的含量處于上升趨勢(shì)。

一段時(shí)間后，隨著微生物代謝活動(dòng)的持續(xù)，泡菜罐中的氧氣消耗殆盡，泡菜中的硝酸鹽含量由于被還原而減少，而乳酸菌等厭氧菌活動(dòng)強(qiáng)烈，產(chǎn)生大量乳酸，這些條件都不利于硝酸鹽還原菌的生長(zhǎng)，因此亞硝酸鹽的產(chǎn)生受到抑制。

2）食醋影響3種泡菜亞硝酸鹽含量的原因。泡菜初期的某些腸桿菌等有害菌能將蔬菜代謝過(guò)程中積累的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。添加食醋使泡菜發(fā)酵液pH下降，酸性環(huán)境不利于有害菌的生長(zhǎng)和代謝，卻有利于乳酸菌的發(fā)酵，從而使得亞硝酸鹽進(jìn)行酸降解［6］。柴政等研究表明0.6%食醋對(duì)泡白菜亞硝酸鹽產(chǎn)生有較好抑制效果［7］，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。但其亞硝酸鹽峰值出現(xiàn)在第5天，而本實(shí)驗(yàn)在第3天，推測(cè)原因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)溫度較高（20～30℃），微生物（硝酸鹽還原菌）活動(dòng)較強(qiáng)，泡菜中能迅速產(chǎn)生大量亞硝酸鹽達(dá)到峰值，期間氧氣消耗較快，之后乳酸菌逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌種，促使亞硝酸鹽含量下降。此外，本研究發(fā)現(xiàn)抑制3種泡菜亞硝酸鹽的最佳食醋濃度不同，推測(cè)可能由于3種蔬菜為不同的植物器官，且表面雜菌種類與數(shù)量存在差異，但根本原因有待進(jìn)一步研究。

3）其他因素影響3種泡菜亞硝酸鹽含量的原因。除食醋外，還有其他諸如食鹽、溫度、泡菜佐料（姜、辣椒）等也會(huì)影響泡菜中亞硝酸鹽含量。泡菜發(fā)酵初期，由于乳酸生成量較少，食鹽的抑菌作用成為主要抑菌因素。較高濃度食鹽有效抑制了硝酸鹽還原菌的活動(dòng)［8］，使硝酸鹽還原過(guò)程減慢，所以亞硝酸鹽增長(zhǎng)趨勢(shì)緩慢，同時(shí)溫度較低，會(huì)使得微生物活動(dòng)較弱，從而導(dǎo)致亞硝酸鹽峰值出現(xiàn)時(shí)間延后及峰值較小。相反，如果食鹽濃度較低且溫度較高，則對(duì)菌的抑制較弱，使得亞硝峰增大。到發(fā)酵中后期時(shí)，乳酸菌活動(dòng)旺盛，大量生成的乳酸會(huì)使腌制液的 pH值迅速下降，從而抑制有害細(xì)菌生長(zhǎng)，減弱硝酸鹽還原菌的還原能力。

由于姜中含有姜油酮、6-姜油酮酚和6-姜烯酚等物質(zhì)，在一定程度上能夠阻斷蔬菜中硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，因此在泡菜中加入適量的姜，對(duì)硝酸還原菌具有一定的抑制作用。

4 建議與啟示

4.1 實(shí)驗(yàn)教學(xué)

1）明晰實(shí)驗(yàn)原理。日常教學(xué)中，本實(shí)驗(yàn)往往停留于教師指導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行重復(fù)的實(shí)驗(yàn)操作，而忽視深層實(shí)驗(yàn)原理，不利于學(xué)生探究性思維的發(fā)展和深度學(xué)習(xí)。因此，教師應(yīng)有關(guān)注實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)的意識(shí)，并培養(yǎng)學(xué)生結(jié)合理論分析實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的能力，從而提高學(xué)生理性思維。

2）精設(shè)實(shí)驗(yàn)方案。教師應(yīng)善于尋找豐富課程資源，大膽創(chuàng)新拓展實(shí)驗(yàn)；不應(yīng)選擇泡制后泡菜液發(fā)生明顯變色的蔬菜原料（例如紅皮蘿卜）；不宜選擇低溫和高鹽條件，也不應(yīng)加入過(guò)多姜和辣椒，否則會(huì)導(dǎo)致亞硝酸鹽含量過(guò)低，從而削弱自變量對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

3）優(yōu)化實(shí)驗(yàn)操作。儀器均需預(yù)熱（例如分光光度計(jì)、離心機(jī)等）；顯色液需現(xiàn)配現(xiàn)用；待測(cè)液靜置時(shí)需嚴(yán)格避光；對(duì)氨基苯磺酸在常溫下難溶于水，應(yīng)用熱水配制；泡菜制作時(shí)裝壇要均勻，測(cè)定時(shí)取樣要均勻。

4.2 實(shí)際生活 制作泡菜時(shí)，泡蘿卜宜加入0.9%食醋，泡白菜時(shí)宜加入0.6%濃度的食醋，泡豇豆時(shí)可根據(jù)個(gè)人喜好添加適量食醋；宜選用較高濃度食鹽水，加入適量姜和辣椒，密封泡菜壇且放置于陰涼處。綜合考慮3種泡菜亞硝酸鹽峰值出現(xiàn)時(shí)間，建議從第6天開始食用。3種泡菜比較而言，泡豇豆中亞硝酸鹽含量很低，且保存時(shí)間較長(zhǎng)，因此豇豆是一種非常好的泡菜原料。