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(重慶工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院,重慶 401120)

天然產(chǎn)物資源是我國(guó)豐富而寶貴的藥庫(kù),隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,世界范圍內(nèi)越來(lái)越重視對(duì)天然資源的開(kāi)發(fā)利用,特別是屠呦呦先生因青蒿素的貢獻(xiàn)而獲得諾貝爾獎(jiǎng)之后,更是引起了廣大學(xué)者對(duì)天然產(chǎn)物特別是中醫(yī)藥的研究熱情。天然產(chǎn)物發(fā)揮功效的物質(zhì)基礎(chǔ)是其所含有的各類(lèi)具有生理活性的化學(xué)物質(zhì)。天然來(lái)源的化學(xué)活性成分大多存在含量低、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、類(lèi)型多樣、性質(zhì)不穩(wěn)定等特點(diǎn),使其中活性物質(zhì)的分離純化存在諸多困難,不利于其物質(zhì)基礎(chǔ)分子水平的研究及其相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)。

傳統(tǒng)天然資源多為龐雜混合物,一般的分離純化方法只能得到粗提物,難以得到單一成分。目前天然活性成分分離純化技術(shù)主要有:萃取分離(雙水相萃取[1]、超臨界萃取[2]等),色譜分離(超臨界流體色譜[3]、高速逆流色譜法[4]等),重結(jié)晶,膜分離,分子蒸餾,大孔樹(shù)脂分離等技術(shù)。為了獲得較高純度的活性成分,目前使用最廣泛的還是各種色譜分離技術(shù)聯(lián)合及反復(fù)重結(jié)晶操作。這些技術(shù)存在操作繁瑣、分離周期長(zhǎng)、效率低、大量消耗溶劑和分離材料、選擇性低等缺點(diǎn)[5]?；诜肿幼R(shí)別的印跡分離技術(shù),具有分離材料制備簡(jiǎn)單,成本低廉,能重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn),而其突出的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)被分離的物質(zhì)具有高度的識(shí)別性能,具有良好的選擇性,且分離操作簡(jiǎn)單,近來(lái)諸多采用分子印跡技術(shù)制備各種印跡聚合物分離材料,并用于天然活性成分的分離純化的研究被報(bào)道,本文旨在從不同形式分子印跡分離材料角度出發(fā),分類(lèi)總結(jié)各種印跡材料在天然活性成分分離純化中的應(yīng)用,以期為相關(guān)科研工作者提供研究參考。

1 分子印跡分離技術(shù)原理

分子印跡的出現(xiàn)源于免疫學(xué)中抗原—抗體模型結(jié)構(gòu),具有類(lèi)似鎖和鑰匙的識(shí)別關(guān)系,分子印跡分離技術(shù)是制備對(duì)目標(biāo)分子具有高度分子識(shí)別的印跡聚合物作為固定相的色譜分離技術(shù)[6]。分子印跡分離技術(shù)首先是將要分離的目標(biāo)分子、交聯(lián)劑、聚合物單體、合適的溶劑以及引發(fā)劑等,在適當(dāng)反應(yīng)條件下進(jìn)行聚合,得到一種高分子聚合物材料,然后經(jīng)洗脫除去包埋于聚合物材料中的模板分子,得到具有印跡位點(diǎn)的印跡高聚物,此聚合物可以將目標(biāo)分子的空間結(jié)構(gòu)保持,留下印跡;當(dāng)將此印跡高聚物作為分離介質(zhì)使用時(shí),混合物樣品中的目標(biāo)分子或其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物能夠被此聚合物識(shí)別,從而達(dá)到高選擇性、特異識(shí)別分離的目的。

圖1 分子印跡技術(shù)制備分離過(guò)程示意Fig.1 Demonstration of preparation and separation of molecular imprinting technique

2 分子印跡技術(shù)在天然活性成分分離中的應(yīng)用

自分子印跡技術(shù)被開(kāi)發(fā)以來(lái),已成為學(xué)界的研究熱點(diǎn),特別是在分析化學(xué)、環(huán)境檢測(cè)等研究領(lǐng)域有較好的應(yīng)用和發(fā)展,而應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性成分的直接分離,則在謝建春等[7]對(duì)于分子印跡法分離槲皮素的報(bào)道之后逐漸增多。作為分離介質(zhì)材料的印跡聚合物,主要有印跡整體柱、印跡微球、印跡膜等,其相關(guān)研究報(bào)道分述如下。

2.1 分子印跡整體柱技術(shù)及其應(yīng)用

整體柱又稱(chēng)連續(xù)床或連續(xù)棒,是在空的管柱中原位聚合,制備出一種全新的,具有優(yōu)異通透性、高空間利用率的剛性聚合物整體柱,是色譜分離中的重要方法技術(shù),它比普通填料柱制備簡(jiǎn)單,從而得到廣泛應(yīng)用[7]。分子印跡整體柱是結(jié)合了分子印跡技術(shù)高選擇性和整體柱的優(yōu)點(diǎn),而開(kāi)發(fā)出來(lái)的用于色譜分離、分析的技術(shù),此技術(shù)也逐漸應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性成分的分離分析。

2.1.1 在黃酮類(lèi)成分分離方面的應(yīng)用 黃酮類(lèi)化合物廣泛存在于自然界,分子印跡整體柱在黃酮類(lèi)化合物的分離純化方面的報(bào)道較多。如楊清清等[9]以黃芩素為研究對(duì)象,采用甲基丙烯酸(MAA)為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)為交聯(lián)劑,二甲基甲酰胺和十二醇為混合致孔劑,在偶氮二異丁腈(AIBN)引發(fā)下,原位聚合出黃芩素分子印跡整體柱,研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)黃芩素和功能單體摩爾比為1∶6時(shí),所得分子印跡整體柱對(duì)模板分子有特異識(shí)別能力,可作為分離黃芩素與其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物漢黃芩素的分離材料。另外,買(mǎi)買(mǎi)提·吐?tīng)栠d等[10]以分子模擬技術(shù)優(yōu)化了模板分子山奈酚和MAA單體比例,通過(guò)自由基法制備了山奈酚分子印跡整體柱,經(jīng)過(guò)性能評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn),此整體柱對(duì)山奈酚及其相似物槲皮素分離度達(dá)1.52,顯示良好的分離性能。而劉伯洋等[11]則以表兒茶素為模板分子,丙烯酰胺為功能單體,原位聚合制備了分子印跡整體柱,并將其作為固相萃取柱,作為富集材料用于分析檢測(cè),結(jié)果表明,當(dāng)模板分子、單體和交聯(lián)劑比例為1∶6∶40時(shí),分子印跡聚合物吸附效果最佳,模板分子回收率84.62%,特異性識(shí)別達(dá)4.55,成功建立分子印跡固相萃取-毛細(xì)管電泳法檢測(cè)六堡茶中表兒茶素。

2.1.2 在生物堿類(lèi)成分分離純化中的應(yīng)用 生物堿主要為來(lái)源于植物界的一類(lèi)含氮有機(jī)物,具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理活性,生物堿一般結(jié)構(gòu)復(fù)雜,含量低,常規(guī)分離手段難以純化。張靜等以MAA為功能單體、EGDMA為交聯(lián)劑,在甲苯和十二醇混合溶劑中,分別以士的寧[12]和麻黃堿[13]為模板分子,制備了相應(yīng)分子印跡整體柱,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),士的寧分子、MAA及交聯(lián)劑比例為1∶4∶16時(shí),所制備的士的寧印跡整體柱適于分離士的寧和馬錢(qián)子堿,分離因子達(dá)到3.5;而通過(guò)對(duì)制備的麻黃堿印跡整體柱水相和有機(jī)相的識(shí)別性能研究后,發(fā)現(xiàn)優(yōu)化條件下可以實(shí)現(xiàn)對(duì)麻黃堿和偽麻黃堿的良好分離,因原位聚合整體柱柱壓低,色譜實(shí)驗(yàn)可在大流速下進(jìn)行,因此分子印跡整體柱有可能實(shí)現(xiàn)規(guī)模制備。孫林等[14]則以激動(dòng)素為模板分子,由MAA單體和EGDMA交聯(lián)劑原位制備了印跡整體柱,并將其成功用于植物樣品中痕量細(xì)胞分裂素的富集,再用于液相色譜的檢測(cè),結(jié)果重復(fù)性好和萃取效率高。分子印跡整體柱在樣品檢測(cè)與處理中也具有良好前景。

2.1.3 在其他類(lèi)成分分離純化中的應(yīng)用 分子印跡整體柱技術(shù)還用于諸如蒽醌、萜類(lèi)、皂苷、肽類(lèi)等天然成分分離分析中。尹艷鳳等[15]以蒽醌類(lèi)化合物大黃素為模板分子,MAA為單體,EGDMA為交聯(lián)劑,在甲苯和十二醇混合溶劑中合成出一系列分子印跡整體柱,結(jié)果均能有效的分離大黃素及其類(lèi)似物,表現(xiàn)出良好的識(shí)別、分離能力。在萜類(lèi)化合物方面,孫蕾等[16]利用原位聚合法制備了樟腦分子印跡整體柱,并將其作為液相色譜固定相,結(jié)果表明,印跡柱對(duì)迷迭香精油中樟腦有專(zhuān)一吸附、富集能力,表現(xiàn)出較高富集率和較低檢出限,可用于HPLC分析前的樣品富集。而張偉等[17]以人參皂苷Re為模板分子,甲基丙烯酸為功能單體,異丙醇和十二醇為致孔劑,原位熱聚合制備了人參皂苷Re分子印跡整體柱,研究了分子印跡技術(shù)在皂苷類(lèi)化合物中的應(yīng)用,結(jié)果整體柱分離因子達(dá)1.769,表現(xiàn)良好。李樺等[18]以縮膽囊素五肽(CCK5)為模板分子合成了其分子印跡整體柱,并以此作為固相微萃取小柱用于液相分析,成功實(shí)現(xiàn)腦脊液中CCK5和CCK8縮膽囊素的富集分離和檢測(cè),將印跡技術(shù)應(yīng)用于肽類(lèi)物質(zhì)分離分析,取得良好效果。

綜上,分子印跡整體柱在天然活性成分的分離分析中應(yīng)用廣泛,展示出較好的發(fā)展前景,特別是在黃酮、生物堿類(lèi)天然活性成分中報(bào)道較多,研究較為深入,可能因?yàn)檫@些成分結(jié)構(gòu)中含有酸、堿官能團(tuán),易于形成氫鍵等聚合物,容易制備且分離效果較好。分子印跡整體柱因其兼具整體柱和印跡分子的特異識(shí)別能力和選擇性,在天然活性成分分離純化和分析檢測(cè)中必將發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

2.2 分子印跡微球技術(shù)及其應(yīng)用

微球顆粒是比較適合作為色譜分離材料的形式,分子印跡微球材料也被廣泛作為印跡色譜填料研究,用于天然活性成分的分離純化研究。目前常用的分子印跡聚合物微球制備方法主要有:本體聚合法、沉淀聚合法、表面印跡法、懸浮聚合法、原位聚合法等,在天然活性成分分離純化中,這些方法制備的印跡微球多有報(bào)道,也各有特點(diǎn)。

2.2.1 本體聚合法 本體聚合法是使用較多也較成熟的方法。該方法將模板分子、單體、交聯(lián)劑、致孔劑、引發(fā)劑混合,首先合成出一大塊的印跡聚合物,然后磨碎,過(guò)篩,再洗脫除去印跡分子,從而獲取具有印跡效果的分離材料。

本體聚合法制備的印跡聚合物在天然活性成分分離方面研究較多,Li等[19]以金絲桃素做模板,經(jīng)本體聚合制備出金絲桃素分子印跡聚合物,經(jīng)過(guò)磨碎、篩分、丙酮反復(fù)沉淀處理,最終收集30～50 μm的顆粒,經(jīng)脫除模板分子后,用于貫葉連翹中金絲桃素的分離純化,結(jié)果回收率達(dá)到82.3%。印跡微球顯示良好識(shí)別性能。王素素等[20]則研究了蘆丁、槲皮素雙模板印跡聚合物的制備和性能,結(jié)果以4-VP作為功能單體,經(jīng)過(guò)本體聚合法制得的印跡聚合物,可從槐花米中同時(shí)分離出蘆丁和槲皮素。這為印跡聚合物同時(shí)分離多組分物質(zhì)提供了思路。

紫杉醇是二萜類(lèi)抗癌藥物,天然來(lái)源含量極低,分離難度極大。閆艷等[21]以紫杉醇為模板分子,經(jīng)本體聚合法制備出對(duì)紫杉醇具有特異識(shí)別吸附能力的印跡聚合物,并建立了從真菌發(fā)酵液中直接快速富集紫杉醇的分離體系,為抗癌藥物紫杉醇的分離富集提供了新技術(shù)支撐,印跡技術(shù)在低含量、高附加值天然活性成分分離中有良好前景。袁波等[22]以姜黃素為模板分子,經(jīng)本體聚合法在丙酮溶劑中制備了其分子印跡聚合物,并篩選出甲基丙烯酸為最佳功能單體,該聚合物對(duì)姜黃素印跡因子達(dá)1.27,可用于姜黃素的分離純化和富集。張乃片等[23]以植酸作為模板分子,制備了分子印跡聚合物,結(jié)果植酸分子印跡聚合物對(duì)模板分子印跡因子達(dá)1.70,對(duì)植酸吸附量達(dá)21.38 umol/g,該聚合物可重復(fù)使用五次以上,印跡材料的重復(fù)使用,可直接降低分離成本。但該研究也同時(shí)指出本體聚合存在對(duì)模板分子包埋過(guò)深,無(wú)法洗脫等缺點(diǎn)。李耀等[24]以花椒麻味兒物質(zhì)為模板分子,MAA功能單體,經(jīng)本體聚合法得到白色塊狀聚合物,經(jīng)研磨,洗脫,得分子印跡聚合物,以此做固相萃取材料,可以分離得到純度為94.09%花椒麻味兒物質(zhì)。將分子技術(shù)應(yīng)用到天然食品添加劑風(fēng)味兒物質(zhì)分離中,獲得良好效果。

本體聚合技術(shù)應(yīng)用較早,技術(shù)成熟,但是所制備的印跡聚合物大多為整體塊狀,要得到印跡微粒必須先要經(jīng)過(guò)研磨、篩分等,操作復(fù)雜,所得微粒不均一、且顆粒大小難以控制,同時(shí),本體聚合法制備的微球?qū)δ０宸肿影裆?難洗脫也是其缺點(diǎn)。

2.2.2 沉淀聚合法 沉淀聚合法是溶于溶液的模板分子、單體、交聯(lián)劑通過(guò)自身交聯(lián),生成不溶于溶劑的印跡微球,并從溶劑中沉淀出微球,即得到印跡聚合物。沉淀聚合法具有反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn),相比于本體聚合法,所制備出的印跡微球無(wú)需研磨,微粒尺寸從納米到微米級(jí),且基本可控,從而成為印跡微球主要制備技術(shù)。

沉淀聚合法操作簡(jiǎn)單,粒徑可控,應(yīng)用廣泛。衣麗娜等[25]以胡黃連苷II為模板分子,以1-Vinyl為功能單體,沉淀聚合法制備了印跡聚合物微粒,該微球可用于從粗提物中靶向分離胡黃連苷II及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物,有助于減少提取分離過(guò)程中有機(jī)溶劑的使用,環(huán)境友好,微球材料直接分離,分離工藝簡(jiǎn)化。Ji等[26]以合成辣椒素作為替代分子模板,合成制備出分子印跡固相萃取材料,用于分離姜辣素及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似系列組分,結(jié)果得到具有更優(yōu)良的自由基清除能力的姜辣素,產(chǎn)品純度達(dá)到99.1%。分子印跡技術(shù)在天然產(chǎn)物活性成分的組分離中顯示出優(yōu)良的性能。Chitos等[27]以綠原酸作為模板分子,MAA作為功能單體,經(jīng)過(guò)沉淀聚合反應(yīng)制備出顆粒尺寸范圍狹窄的分子印跡微球,并用于杜仲葉中綠原酸的分離,結(jié)果表明,分子印跡聚合物顆粒能成功分離出綠原酸,而對(duì)咖啡酸、沒(méi)食子酸、原兒茶酸和香草酸等則無(wú)識(shí)別。Sushma等[28]以沒(méi)食子酸作為模板分子,經(jīng)沉淀聚合法制備印跡聚合物,著重研究了致孔劑對(duì)聚合物微球的顆粒尺寸和分子識(shí)別性能,結(jié)果所制備的分子印跡微球和分子印跡納米顆粒均可對(duì)余柑子水提物中的沒(méi)食子酸實(shí)現(xiàn)良好的識(shí)別、分離。王松等[29]以黃芩素作為模板分子,選用MAA作為功能單體,EGDMA為交聯(lián)劑,在AIBN引發(fā)下,考察了不同溶劑用量下,以沉淀聚合法制備的印跡微球性能,結(jié)果表明,當(dāng)固定模板分子和功能單體比例為1∶4時(shí),溶劑用量對(duì)微球粒徑影響顯著,溶劑用量越大,粒徑越大,對(duì)分子越具有選擇性吸附,但是吸附量卻隨粒徑增大而減小,由此說(shuō)明在印跡聚合物制備過(guò)程中,溶劑用量會(huì)因?yàn)橛绊懙筋w粒粒徑,進(jìn)而影響分子識(shí)別數(shù)量,可能因?yàn)榫酆衔镱w粒越大,比表面積相對(duì)減小,從而吸附量減少。

沉淀法制備印跡微球方法簡(jiǎn)單,微球易分離,但也存在對(duì)模板分子包埋深,模板分子難以從印跡微球洗脫的問(wèn)題,進(jìn)而導(dǎo)致目標(biāo)分子在印跡微球中吸附傳質(zhì)速度慢等缺點(diǎn)。

2.2.3 表面印跡法 表面印跡法即在載體表面,通過(guò)改性后進(jìn)行印跡制備,一般采用硅膠等作為載體,在其表面接枝一些活性基團(tuán),通過(guò)此法制備的聚合物不需要經(jīng)過(guò)研磨等后期處理,直接得到微球狀分子印跡聚合物,較好保留了聚合物完整性,且表面印跡的印跡層在載體表面,易于分子快速識(shí)別吸附和傳質(zhì)。

不同載體材料被用于表面印跡聚合物的制備,顧小麗等[30]以介孔分子篩MCM-41為基質(zhì),黃芩苷為模板分子,以丙烯酰胺(AM)為功能單體,EGDMA為交聯(lián)劑,在乙醇溶液中經(jīng)AIBN引發(fā),熱聚合制備出對(duì)黃芩苷具有選擇性吸附的表面分子印跡聚合物,為從天然藥物黃芩中分離富集黃芩苷提供一種新材料,該方法以乙醇作為溶劑,相比于甲醇、乙腈等具有低毒、安全的優(yōu)勢(shì)。謝宏凱等[31]以硅膠作為載體,經(jīng)過(guò)對(duì)硅膠表面接枝APTES和甲基丙烯酰氯,制備出改性載體AA-APTES-Silica,在乙腈中加入以AM為單體,經(jīng)兩步法制備出三七素表面分子印跡聚合物,該聚合物可快速?gòu)娜咛崛∫褐蟹蛛x富集三七素,純度達(dá)98.7%,回收率83.7%,效果良好。陳曉龍等[32]以α-(羥基)-山椒素分子結(jié)構(gòu)類(lèi)似物為模板分子、2-乙烯基吡啶(2-Vpy)為功能單體,EGDMA為交聯(lián)劑,在氨基硅膠表面接枝AM,制備了花椒麻味兒物質(zhì)表面印跡聚合物,以此作為固相萃取材料,可以分離出純度達(dá)93.66%花椒麻味兒物質(zhì),該法快速、經(jīng)濟(jì)、高效。充分體現(xiàn)表面印跡傳質(zhì)優(yōu)勢(shì)。

除上述載體材料外,具有磁性的Fe3O4也經(jīng)常作為載體材料,用于表面印跡聚合物的制備,磁性材料的加入在外加磁場(chǎng)作用下可實(shí)現(xiàn)快速分離,增加了分離速度。Gao等[33]以根皮苷為模板分子,以修飾的Fe3O4微粒作為磁核載體,在其表面印跡聚合成了兼具磁性和印跡識(shí)別的聚合物顆粒,聚合物對(duì)根皮苷的吸附量和選擇識(shí)別能力遠(yuǎn)高于黃芩苷等,將其用于臺(tái)灣木檎葉中根皮苷的分離富集時(shí),回收率達(dá)81.45%～90.7%,用于大鼠血清中根皮苷檢測(cè)時(shí),可檢測(cè)到血藥濃度范圍達(dá)12.19±0.84 ug/mL,結(jié)果表明,磁性表面分子印跡聚合物具有良好的傳質(zhì)和特異識(shí)別分離富集效果。Zhao等[34]以Fe3O4@NH2為原料,首先制備出H-Fe3O4@NH2,再加入模板分子綠原酸和功能單體多巴胺,經(jīng)聚合制備成磁性分子印跡聚合物,并成功用于金銀花中綠原酸的富集和檢測(cè),結(jié)果表明,此法制備的綠原酸印跡聚合物,具有高選擇性和快速吸附的優(yōu)勢(shì),且制法簡(jiǎn)單、快捷、專(zhuān)一而聚合物易回收并重復(fù)使用。

2.2.4 懸浮聚合法 懸浮聚合一般是將模板分子、單體和交聯(lián)劑先溶于有機(jī)溶劑中,然后再轉(zhuǎn)移到含有穩(wěn)定劑的水相中,通過(guò)攪拌制備印跡聚合物,此法聚合操作簡(jiǎn)單,較常用。

懸浮聚合制備技術(shù)方面,王婧等[35]以單步溶脹聚合法制備了和厚樸酚印跡聚合物微球,制備過(guò)程為:先將和厚樸酚、AM溶解于氯仿,再依次加入EGDMA、鄰苯二甲酸丁酯和引發(fā)劑AIBN,混合后再加入十二烷基磺酸鈉和聚乙烯醇混合溶液,最后加入聚苯乙烯微球分散液,聚合制備出印跡微球。靜態(tài)吸附試驗(yàn)表明,聚合物微球?qū)δ０宸肿泳哂袕?qiáng)的特異吸附能力,與厚樸酚分離因子達(dá)到1.85。馬曉琴等[36]以茄尼醇為模板分子,以丙烯酸甲酯為單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑,在氯仿中制備分散相,以表面活性劑聚乙烯醇溶于水作為連續(xù)相,再將分散相緩慢滴加到連續(xù)相,并于60 ℃在氮?dú)獗Ｗo(hù)下持續(xù)6 h,制得印跡聚合物,通過(guò)懸浮聚合可以制備出大粒徑球形茄尼醇印跡聚合物,在Flash空柱管考查聚合物對(duì)煙葉中茄尼醇的提取效果,結(jié)果表明,從14.7 g煙葉中提取出純度大于97%的茄尼醇370.8 mg,實(shí)現(xiàn)良好分離純化。同時(shí),馬曉琴還以反相懸浮聚合法制備出白堅(jiān)木皮醇分子印跡聚合物,該聚合物對(duì)白堅(jiān)木皮醇吸附量達(dá)到45 mg/g,經(jīng)Flash柱分離,1.8 g聚合物在2 h內(nèi)可制備285.1 mg純度大于94%的白堅(jiān)木皮醇。表現(xiàn)出良好的識(shí)別分離性能。

綜上,印跡聚合物微球作為分離介質(zhì),適于作為色譜填料被廣泛應(yīng)用,是一種具有特殊識(shí)別選擇性的新型分離材料,印跡微球制備技術(shù)也不斷發(fā)展,上述制備方法中,表面聚合法制備的分子印跡聚合物印跡反應(yīng)發(fā)生在載體表面,印跡微球兼具特異識(shí)別和吸附傳質(zhì)速度快的優(yōu)點(diǎn),具有明顯優(yōu)勢(shì)。當(dāng)表面聚合結(jié)合特殊功能團(tuán)如磁性微球等功能物質(zhì)后,更加易于在復(fù)雜體系中分離富集目標(biāo)分子,在天然產(chǎn)物這一復(fù)雜系統(tǒng)的分離分析中具有良好應(yīng)用前景。

2.3 分子印跡膜技術(shù)及其應(yīng)用

分子印跡膜的原理[37]是首先在聚合介質(zhì)中加入印跡分子,聚合成膜后再將印跡分子脫除,從而在聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中留下印跡分子的功能尺寸,生成的聚合物與印跡分子之間存在相互作用,將此印跡膜用于分離含有印跡分子的混合物時(shí),該膜能從混合物中識(shí)別出印跡分子,從而有效地將其選擇性分離。分子印跡膜技術(shù)在天然活性成分方面的應(yīng)用主要有兩方面:一是作為分離材料用于純化制備,一是作傳感元件用于分析檢測(cè)中的吸附富集。

2.3.1 分子印跡分離膜 分子印跡膜分離技術(shù)將印跡技術(shù)和膜分離技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)相耦合,使分子印跡膜兼具有操作方便、能耗低、分子特異識(shí)別等優(yōu)點(diǎn),可用于分離高純度、單一化合物,區(qū)別于現(xiàn)有膜分離中的超濾、微濾和反滲透等膜技術(shù)[38]。分子印跡膜技術(shù)已從分離小分子化學(xué)藥物、氨基酸、超分子物質(zhì)發(fā)展到多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸等生物大分子[39],具有獨(dú)特優(yōu)越性和廣闊應(yīng)用前景。

分子印跡膜的制備一般在支撐膜材料上進(jìn)行印跡修飾,所制備的印跡膜兼具印記功能和膜分離功能,用于天然活性成分的分離優(yōu)勢(shì)明顯。王嬌等[40]以聚偏氟乙烯(PVDF)微孔濾膜為支撐膜,以阿魏酸為模板,MAA為功能單體、EGDMA為交聯(lián)劑,紫外引發(fā)下,原位聚合制備出阿魏酸分子印跡復(fù)合膜,經(jīng)阿魏酸提取分離實(shí)驗(yàn)表明,印跡膜對(duì)阿魏酸的結(jié)合容量比對(duì)其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物肉桂酸高,選擇因子達(dá)1.9。董勝?gòu)?qiáng)等[41]以聚偏氟乙烯(PDVF)為載體膜,MAA為單體、EGDMA為交聯(lián)劑,在乙腈溶液中,熱聚合制備出香豆素印跡復(fù)合膜,結(jié)果表明,該膜對(duì)香豆素具有高吸附高選擇,能從桂枝的甲醇粗提液中選擇性提取分離出香豆素,回收率達(dá)到89.6%。呂建峰等[42]以聚酰胺酸溶液為原料,首先采用靜電紡絲法,制備了聚酰胺酸納米纖維膜,經(jīng)熱處理脫水后,獲得聚酰亞胺納米纖維膜,再經(jīng)表面預(yù)涂覆聚甲基丙烯酸,加入模板分子茶堿、EGDMA,在氯仿溶液中由AIBN引發(fā)交聯(lián),最終合成茶堿分子印跡聚酰亞胺納米纖維復(fù)合膜,經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,該印跡膜對(duì)茶堿和可可堿選擇性分離因子達(dá)1.96。Nasser等[43]以槲皮素為模板分子,以AM為功能單體,制備了丙烯腈分子印跡膜,用于槲皮素、柚皮苷及白楊素的分離,結(jié)果表明,槲皮素與柚皮苷及白楊素都可以達(dá)到較好的分離,選擇因子分別為4.5和1.8,印跡膜表現(xiàn)出對(duì)模板分子高度選擇性。Sahar等[44]以紫杉醇為模板分子,聚砜作為膜材料,制備出紫杉醇分子印跡膜,并用于紅豆杉提取物中紫杉醇的分離制備,結(jié)果表明,優(yōu)選出的印跡膜其印跡因子達(dá)2.28,印跡膜重復(fù)使用三次后,選擇性識(shí)別幾乎無(wú)變化,經(jīng)與紫杉醇傳統(tǒng)硅膠色譜分離工藝比較,印跡膜分離技術(shù)大大簡(jiǎn)化分離步驟,且其高選擇性和低成本優(yōu)勢(shì)明顯。

分子印跡復(fù)合膜作為分離材料,具有膜分離的低能耗、選擇性篩分及印跡物的特異識(shí)別能力和高度選擇性等特點(diǎn),在天然活性成分分離純化應(yīng)用方面的研究越來(lái)越深入,但目前印跡膜制備主要局限于實(shí)驗(yàn)室研究,以在支撐膜上進(jìn)行印跡修飾制備印跡復(fù)合膜為主,且可供選擇的支撐膜種類(lèi)較少,同時(shí)印跡膜成品的膜通量也需要提高,因此印跡膜分離走向工業(yè)化實(shí)用階段仍有一定距離。但可以肯定的是該分離材料對(duì)復(fù)雜體系確實(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),當(dāng)組裝成膜組件后樣品處理量可以顯著提高,在復(fù)雜樣品體系特別是天然活性成分分子的選擇性分離方面,具有良好的應(yīng)用前景。

2.3.2 印跡膜傳感器 傳感分析中搜集目標(biāo)分子是重要一步,印跡膜具有選擇性吸附富集目標(biāo)分子的優(yōu)點(diǎn),可作為選擇性傳感器元件。特別是在電化學(xué)分析檢測(cè)中,印跡膜傳感元件應(yīng)用多,為天然活性成分的檢測(cè)提供了新方法。

印跡膜傳感技術(shù)目前主要與電化學(xué)技術(shù)耦合,李利軍等[45]以綠原酸為模板分子,鄰二苯胺為功能單體,經(jīng)循環(huán)伏安法,在玻碳電極表面構(gòu)建了綠原酸分子印跡電極,選擇性實(shí)驗(yàn)表明,咖啡酸、阿魏酸、香草酸等10倍于綠原酸條件下也不會(huì)干擾測(cè)試,印跡膜電極對(duì)綠原酸具有良好選擇性,實(shí)際樣品清肝利膽口服液測(cè)定時(shí),其回收率達(dá)101.6%。重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)表明,該印跡膜電極具有良好重現(xiàn)性,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差2.1%,電極使用20次后,綠原酸響應(yīng)電流降為89%,說(shuō)明電極具有較長(zhǎng)使用壽命,但響應(yīng)時(shí)間變長(zhǎng)是其不足之處。劉蓉等[46]以鄰氨基酚為功能單體,桑色素為模板分子,在金電極表面電聚合了具有特異識(shí)別孔穴的桑色素分子印跡傳感膜,對(duì)桑色素相似物如蘆丁、槲皮素等的選擇性響應(yīng)研究表明,該聚合物對(duì)桑色素具有良好選擇性,此傳感器對(duì)桑色素測(cè)定范圍為0.05～1.70 μmol/L,用于黑茶樣品測(cè)定時(shí),加標(biāo)回收率為104.0%～108.0%。藍(lán)慰瑜等[47]以莽草酸為模板分子,2-乙烯吡啶為功能單體,本體聚合法制備出分子印跡聚合物,然后負(fù)載于聚氯乙烯膜中,構(gòu)成電極敏感膜,制備出離子選擇性電極。結(jié)果表明,對(duì)八角茴香中莽草酸含量測(cè)定時(shí),具有較高靈敏度、選擇性和準(zhǔn)確度、精密度,測(cè)定結(jié)果與紫外分光光度法一致。

傳感分析檢測(cè)中,首先要識(shí)別富集目標(biāo)分子,進(jìn)而產(chǎn)生響應(yīng)信號(hào),而分子印跡膜可快速實(shí)現(xiàn)高度特異性識(shí)別和富集,這一優(yōu)點(diǎn)作為傳感器敏感元件,具有廣闊應(yīng)用前景。

3 展望

分子印跡技術(shù)自開(kāi)發(fā)以來(lái),因其特異識(shí)別性能、制備簡(jiǎn)單、操作方便等優(yōu)點(diǎn),立即引起了廣泛關(guān)注,并得到飛速發(fā)展。本文從不同印跡材料角度出發(fā),分析討論了印跡整體柱、印跡微球及印跡膜分離材料在天然活性成分分離分析中的應(yīng)用,認(rèn)為印跡技術(shù)在天然活性成分分離純化中有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和良好應(yīng)用前景。但是也存在一些問(wèn)題:分子印跡整體柱存在負(fù)載容量小等問(wèn)題,適用于分析檢測(cè)而不適于制備純化;以印跡材料分離純化天然活性成分的研究,現(xiàn)多局限在實(shí)驗(yàn)室模擬分離結(jié)構(gòu)類(lèi)似物等,對(duì)于實(shí)際復(fù)雜體系中活性分子的分離研究報(bào)道有限,無(wú)論是分子印跡整體柱,微球顆粒都存在功能單體、交聯(lián)劑等種類(lèi)較少的問(wèn)題,也一定程度限制了各類(lèi)成分印跡物的研究,需要開(kāi)發(fā)更多適于各類(lèi)天然活性成分的功能單體;分子印跡技術(shù)關(guān)鍵要有合適的印跡模板分子,而天然活性單體一般較難獲取,印跡模板分子缺乏,其制備仍然要依賴(lài)于傳統(tǒng)分離技術(shù)首先獲取得到模板分子或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物,相關(guān)研究受限;天然活性成分印跡聚合物的制備多集中在酚類(lèi)、黃酮、生物堿等具有酸、堿官能團(tuán)的物質(zhì)的分離上,而其他結(jié)構(gòu)類(lèi)別研究報(bào)道則較少涉及,今后應(yīng)該加大各類(lèi)型天然產(chǎn)物印跡材料的制備研究。

總之,分子印跡技術(shù)已經(jīng)在天然活性成分的分離分析等方面有了廣泛而深入的基礎(chǔ)研究,對(duì)于天然活性成分的分離純化研究,也必將隨著分子印跡技術(shù)的成熟更加深入,并且顯現(xiàn)廣闊的前景,特別是以分子印跡聚合物微球和分子印跡膜為分離材料的新型印跡分離技術(shù),將是未來(lái)適合天然活性成分的規(guī)模化制備技術(shù),值得重點(diǎn)開(kāi)發(fā);分子印跡分離純化技術(shù)也必將成為天然活性成分深入研究的有力技術(shù)保障。