周明羅，陳 杰，游 玲，王 濤

（1.宜賓學(xué)院 資源與環(huán)境工程學(xué)院，四川 宜賓 644007；2.宜賓學(xué)院 發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644007）

微生物絮凝劑是一類具有絮凝活性的微生物代謝產(chǎn)物或分泌物，主要成分為蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖及脫氧核糖核酸等物質(zhì)，具有大量的氨基、肽鍵、羥基、芳環(huán)等多種活性官能團(tuán)[1-3]，這些官能團(tuán)的電性差異能使水中細(xì)小顆粒物及膠體態(tài)物質(zhì)吸附、凝聚、沉淀，從而有效去除污水中的懸浮物（suspended solids，SS）及膠體物質(zhì)。微生物絮凝劑對(duì)有機(jī)物、濁度、色度、金屬離子等污染物的去除及污泥脫水均有良好效果[4-6]，具有高效、廣譜絮凝、生物可降解、安全無毒、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，長(zhǎng)期以來受到國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注。目前，在絮凝機(jī)理、活性成分、絮凝活性微生物來源、應(yīng)用條件等[7-10]方面都有大量研究。然而，微生物絮凝劑工業(yè)化發(fā)展緩慢，實(shí)際工程應(yīng)用仍然較少，生產(chǎn)制備成本高是主要限制因素之一。其中，培養(yǎng)基成本約占微生物絮凝劑生產(chǎn)總成本70%[11-12]。因此，探求優(yōu)良、廉價(jià)的培養(yǎng)基，是克服這一瓶頸的有效途徑。

眾多學(xué)者研究了以豆腐廢水、啤酒廢水、釀醋廢水、屠宰廢水等作為培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)絮凝菌進(jìn)行培養(yǎng)[13-15]，而以白酒釀造廢水作為廉價(jià)培養(yǎng)基還鮮有報(bào)道。白酒釀造大多以小麥、高粱、玉米等為原輔料，其生產(chǎn)廢水主要包括黃水、底鍋水等，含有大量蛋白質(zhì)、糖類、淀粉等含碳、氮有機(jī)物[16]，這些含碳、氮物質(zhì)是微生物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物。本研究從活性污泥中分離產(chǎn)絮菌，以白酒釀造廢水為廉價(jià)培養(yǎng)基，可有效降低白酒廢水中的有機(jī)物污染物濃度，實(shí)現(xiàn)以廢治廢，同時(shí)將白酒廢水中含碳、含氮有機(jī)物資源化利用以降低微生物絮凝劑的培養(yǎng)成本，為微生物絮凝劑選取廉價(jià)培養(yǎng)基提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與廢水

菌種從宜賓市城市污水處理廠周期循環(huán)活性污泥法（cyclic activated sludgesystem，CASS）生化池的活性污泥中篩選、分離獲得。

白酒釀造廢水取自宜賓某酒業(yè)公司釀造車間黃水及底鍋廢水，主要污染物濃度為總氮（total nitrogen，TN）210.5 mg/L、總磷（total phosphorus，TP）25.6 mg/L、化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD）20.8 g/L、五日生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD5）10.2 g/L。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

主要試劑：培養(yǎng)基原料（化學(xué)純）、高嶺土、NaOH（分析純）、鹽酸（工業(yè)級(jí)）等；

富集、分離培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10 g，瓊脂12 g（富集培養(yǎng)基中不添加），NaCl 4.0 g，pH=7.0～7.2，加水至1 L，121℃滅菌20 min；

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15g、MgSO40.3g、（NH4）2SO40.3g、酵母膏0.75 g、尿素0.75 g、KH2PO43 g、K2HPO47.5 g、pH 7.1，加水至1 L，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

78HW-1恒溫培養(yǎng)箱、BSD-YXF2200恒溫?fù)u床：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SANYO高壓滅菌鍋：SANYO公司；DM 2000光學(xué)顯微鏡：德國(guó)萊卡公司；Lynx6000離心機(jī)：美國(guó)thermo公司；PHS-3CpH計(jì)：上海雷磁儀器廠；無菌操作臺(tái)、TU-1901紫外可見光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；EppendorfAG分子擴(kuò)增PCR儀：德國(guó)Eppendorf公司；Malvern Mastersizer 3000E粒徑分析儀：英國(guó)Malvern公司等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種分離與鑒定

菌株分離：取CASS反應(yīng)池的混合液2mL，加入98mL富集培養(yǎng)基中，在35.8℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min條件下，培養(yǎng)時(shí)間24 h后，取發(fā)酵培養(yǎng)液用無菌水稀釋1 000倍后，取1 mL接種于分離培養(yǎng)基上，32℃恒溫培養(yǎng)36 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單菌落，繼續(xù)在分離培養(yǎng)基平板劃線純化3次，得到純培養(yǎng)菌株，轉(zhuǎn)接到分離培養(yǎng)基斜面上，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

絮凝菌株篩選：將分離純化獲得的菌株，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，120 r/min、32℃振蕩培養(yǎng)72 h獲得發(fā)酵液，根據(jù)發(fā)酵液對(duì)高嶺土懸濁液的絮凝效果，選出高效的絮凝劑產(chǎn)生菌。

菌株鑒定：根據(jù)文獻(xiàn)[17]提供的方法，適當(dāng)修改。提取培養(yǎng)物基因組DNA后，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechain reaction，PCR）擴(kuò)增16SrDNA。細(xì)菌引物[18]27f：5'-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3'和1541r：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行，菌株16Sr DNA測(cè)序由上海立菲生物技術(shù)有限公司完成，將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)，通過Blast與模式菌株比對(duì)，將其鑒定到種。

1.3.2 微生物絮凝劑的制備

將優(yōu)選獲得的菌株，在設(shè)定條件下培養(yǎng)，獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液即為微生物絮凝劑，采用單因素法，考察白酒廢水COD、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH、外加氮源、磷源等因素對(duì)絮凝效果的影響，并優(yōu)化白酒釀造廢水制備微生物絮凝劑的培養(yǎng)條件。

1.3.3 絮凝效果的測(cè)定

向100 mL 4 g/L的高嶺土懸濁液中加入5 mL微生物絮凝劑（發(fā)酵培養(yǎng)液），于200 mL燒杯中快速攪拌1 min，慢速攪拌3 min，靜置20 min，取上清液用紫外可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)吸光度值，每次3個(gè)平行樣，并按式（1）計(jì)算絮凝率（η）。

式中：Ao為原懸濁液吸光度值；A為絮凝后懸濁液吸光度值。

1.3.4 水質(zhì)及絮體粒徑測(cè)定方法

COD的測(cè)定采用HJ/T 399—2007《水質(zhì)化學(xué)需氧量的測(cè)定快速消解分光光度法》；BOD5的測(cè)定采用HJ 505—2009《水質(zhì)五日生化需氧量的測(cè)定稀釋與接種法》；NH3-N的測(cè)定采用HJ535—2009《水質(zhì)氨氮的測(cè)定納氏試劑分光光度法》；總氮的測(cè)定：采用HJ 636—2012《水質(zhì)總氮的測(cè)定》中的過硫酸鉀消解法；總磷的測(cè)定：采用HJ671—2013《水質(zhì)總磷的測(cè)定》中的鉬酸銨法。

污水中絮體粒徑用Malvern Mastersizer 3000E粒徑分析儀測(cè)定，D10表示絮體顆粒的累積含量為10%時(shí)對(duì)應(yīng)的絮體粒徑，其值越小反映細(xì)微顆粒越多；D90表示絮體顆粒的累積含量為90%時(shí)對(duì)應(yīng)的絮體粒徑，其值越大反映大顆粒越多。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選與鑒定結(jié)果

2.1.1 菌株的篩選

圖1 不同菌株的絮凝效果Fig.1 Flocculation effect of different strains

共篩選到12株產(chǎn)絮菌，依次編號(hào)為HN1～HN12。在發(fā)酵培養(yǎng)基中在溫度32℃、轉(zhuǎn)速120 r/min條件下，培養(yǎng)48 h，并對(duì)發(fā)酵液的絮凝效果進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖1。分析絮凝率可知，產(chǎn)絮菌HN2、HN5培養(yǎng)發(fā)酵液絮凝效果較好，絮凝率分別為69.3%、76.1%。為此，選擇絮凝率最高的產(chǎn)絮菌HN5為實(shí)驗(yàn)菌株。

2.1.2 菌株鑒定

絮凝效果最好的產(chǎn)絮菌HN5顏色呈乳白色、邊緣整潔、表面濕潤(rùn)、微凸、單菌落直徑2 mm左右，革蘭氏陰性；其16SrDNA序列比對(duì)結(jié)果見表1。由表1可知，菌株HN5 16S rDNA序列與Ochrobactrum pseudintermedium ADV31（Genbank no.NR043756.1）的相似度最高，為99%，與其余種屬的相似性均低于97%。故將HN5菌株初步鑒定為假中間蒼白桿菌（Ochrobactrumpseudintermedium）。該種屬細(xì)菌廣泛分布于活性污泥環(huán)境，如王麗[19]從活性污泥中分離獲得蒼白桿菌（Ochrobactrum sp.）、蘇峰等[20]從生活污水站曝氣池活性污泥中分離獲得Ochrobactrum sp.Azn6.1產(chǎn)絮菌。

表1 菌株HN5的16S rDNA系列比對(duì)結(jié)果Table 1 Alignment results of 16S rDNA sequence of strain HN5

2.2 白酒廢水制備微生物絮凝劑的條件

2.2.1 廢水COD對(duì)絮凝效果的影響

將白酒廢水（COD 20.8 g/L）分別稀釋2、3、4、5、6、8倍作為發(fā)酵培養(yǎng)基，以菌株HN5預(yù)發(fā)酵液按2%接種量接入，在32℃、轉(zhuǎn)速120 r/min條件下，恒溫培養(yǎng)60 h，考察不同COD濃度對(duì)絮凝效果的影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)白酒廢水COD為4.2～6.9 g/L時(shí)，絮凝率在70.4%以上，其中效果最好為78.4%，此時(shí)稀釋倍數(shù)為4，COD為5.2 g/L。COD濃度太高時(shí)有機(jī)碳源負(fù)荷過高或COD濃度過低時(shí)碳源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不夠，都不利于微生物生長(zhǎng)并抑制多糖類物質(zhì)的分泌，而多糖物質(zhì)是微生物絮凝劑的主要成分[4，21]。

圖2 不同COD對(duì)絮凝效果的影響Fig.2 Effect of different COD on flocculation

2.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)絮凝效果的影響

在白酒廢水COD 5.2 g/L、32℃、120 r/min培養(yǎng)條件下，考察不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)絮凝效果的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，絮凝率先增大后減小，培養(yǎng)時(shí)間在60 h、72 h、84h時(shí)絮凝率分別為78.8%、80.1%、74.2%，在72 h時(shí)絮凝率最高，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增大，發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，菌體細(xì)胞的代謝方向發(fā)生變化，粘性有機(jī)大分子代謝產(chǎn)物減少，使得微生物絮凝劑活性減弱。因此，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間在60～72 h為宜。

圖3 不同時(shí)間對(duì)絮凝效果的影響Fig.3 Effect of different time on flocculation

2.2.3 培養(yǎng)pH對(duì)絮凝效果的影響

圖4 不同pH對(duì)絮凝效果的影響Fig.4 Effect of different pH on flocculation

在白酒廢水COD 5.2 g/L、32 ℃、120 r/min條件下，培養(yǎng)60 h后，用HCl和NaOH溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值，考察不同pH對(duì)絮凝效果的影響，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，廢水pH值為6、7、8時(shí)絮凝效果較好，絮凝率達(dá)到72.1%以上，即在弱酸性、中性、弱堿性條件下的絮凝效果較好。原因是培養(yǎng)液pH值會(huì)影響氧化還原電位的大小以及有機(jī)物的離子化作用，從而影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用和絮凝物質(zhì)的分泌；同時(shí)生物酶只能在一定pH值下才能發(fā)揮高活性，pH值過高或過低都將降低酶的活性。

2.2.4 外加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)絮凝效果的影響

白酒廢水COD 5.2 g/L，pH調(diào)整為7.0±0.1，在32℃、120 r/min條件下，添加不同量的（NH4）2SO4、KH2PO4，培養(yǎng)60 h，考察不同外加氮、磷量對(duì)絮凝效果的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，隨著（NH4）2SO4量的增大，絮凝效果變化甚微，說明白酒廢水中有足夠氮源供微生物所需，不需要外加氮源；隨著KH2PO4的添加量增大，絮凝率逐漸變大，當(dāng)添加量增大到2.0 g/L以后，繼續(xù)增大投加量，絮凝率增大不明顯，KH2PO4的適宜添加量為2.0 g/L。

圖5 外加物質(zhì)對(duì)絮凝效果的影響Fig.5 Effect of additional nutrient on flocculation

2.3 對(duì)生活污水的處理效果

在白酒廢水COD 5.2 g/L、KH2PO42.0 g/L、培養(yǎng)基初始pH值7.0±0.1、32℃、120 r/min條件下，培養(yǎng)60 h后，向100 mL生活污水中加入不同體積發(fā)酵培養(yǎng)液，其絮凝效果及對(duì)COD、懸浮物（SS）、氨氮（NH3-N）去除率結(jié)果如圖6所示，絮凝率最高時(shí)污水中絮體粒徑如圖7所示。

由圖6可知，HN5產(chǎn)絮菌發(fā)酵培養(yǎng)液對(duì)生活污水絮凝和SS去除有很好的效果，并且隨著發(fā)酵液投加量的增加，其去除率先增大后減少，絮凝劑投加量為6 mL/100 mL時(shí)，絮凝效果最高為86.8%、SS去除率高達(dá)92.5%。COD的去除率低于SS的去除率；隨著發(fā)酵液投加量的增加，NH3-N去除率未出現(xiàn)規(guī)律性增加，且去除率均低于20%。這是因?yàn)樯钗鬯杏写罅咳芙庑訡OD，以及污水中NH3-N為溶解性的，而絮凝對(duì)溶解性物質(zhì)沒有顯著去除效果。SS的高去除率和高絮凝效果，說明微生物絮凝劑對(duì)膠體、懸浮物形成絮體起到了正效應(yīng)，能有效加強(qiáng)懸浮物、膠體物及微生物絮凝劑之間的相互作用，促進(jìn)架橋聯(lián)接和大顆粒絮體形成進(jìn)而增強(qiáng)絮凝效果；但隨著絮凝劑投加量的進(jìn)一步增加，會(huì)在水中形成反電位而使絮凝效果下降[7，22]。由圖7可知，加入了微生物絮凝劑的污水D10較小，說明細(xì)微顆粒所占的比例高于空白污水；投加絮凝劑后，污水D90對(duì)應(yīng)的粒徑開始時(shí)大于未投加絮凝劑的污水，沉降一定時(shí)間后，小于空白污水，說明加入絮凝劑后，促進(jìn)了絮體的形成，且生活污水中形成的絮體顆粒易于沉降，進(jìn)而表明菌株HN5產(chǎn)生的絮凝劑適宜于生活污水的絮凝處理，能有效去除懸浮物。

圖6 菌株發(fā)酵培養(yǎng)液對(duì)生活污水處理的效果Fig.6 Effect of fermentation medium on domestic sewage treatment

圖7 生活污水中絮體粒徑Fig.7 Flocs size in domestic sewage

3 結(jié)論

從活性污泥中分離獲得的產(chǎn)絮菌HN5，經(jīng)鑒定為假中間蒼白桿菌（Ochrobactrum pseudintermedium），培養(yǎng)產(chǎn)生的發(fā)酵液具有較好的絮凝效果，對(duì)高嶺土懸濁液絮凝率最高可達(dá)84.9%。

利用白酒釀造廢水作為替代培養(yǎng)基，產(chǎn)絮菌HN5發(fā)酵液仍具有較高的絮凝率，影響其絮凝效果的主要因素包括白酒釀造廢水COD、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基pH值、外加磷源；適宜的培養(yǎng)條件為COD 5.0～6.9 g/L，培養(yǎng)時(shí)間60～72 h，pH值6～8，KH2PO42.0 g/L。

用產(chǎn)絮菌HN5發(fā)酵液處理生活污水，當(dāng)絮凝劑投加量為6.0 mL/100 mL時(shí)，效果最好，絮凝率達(dá)到86.8%、SS去除率高達(dá)92.5%。白酒釀造廢水用于產(chǎn)絮凝菌的培養(yǎng)，微生物絮凝劑具有較高的絮凝效果。