葉廣彬，陳源紅，王長(zhǎng)麗，楊睿睿，賓曉蕓，銀聯(lián)飛*

（右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類能夠利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌，作為公認(rèn)安全的益生菌，乳酸菌具有促進(jìn)腸道有益微生物的生長(zhǎng)、緩解乳糖不耐癥、降低膽固醇、抗氧化等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[1-2]。乳酸菌胞外多糖（expolysaccharides，EPS）是乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過程中發(fā)酵產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外的黏液或莢膜多糖，是一種天然高分子聚合物[3]。能夠產(chǎn)生EPS的乳酸菌主要包括：片球菌屬（Pediococcus）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、檸檬明串株菌（Leu.citreum）、魏斯氏菌（Weissella）、干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）、德氏乳桿菌（Lb.delbruecckii）、瑞士乳桿菌（Lb.helveticus）、馬乳酒樣乳桿菌（Lb.kefiranofaciens）、嗜酸乳桿菌（Lb.acidophilus）、乳酸乳球菌（Lc.1actis）、嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）等[4-6]。其中20世紀(jì)40年代開發(fā)出的由Leu.mesenteroides產(chǎn)生的右旋糖酐是最早被開發(fā)利用的乳酸菌胞外多糖，也是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug admin istration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的第一種可用于食品的微生物EPS[7]。大量研究表明，乳酸菌胞外多糖具有降低膽固醇、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)消化道等特點(diǎn)，能夠使微生物在脫水、營(yíng)養(yǎng)缺乏、有毒物質(zhì)、噬菌體、滲透壓和拮抗物等不利條件下生存[8-9]。目前，乳酸菌胞外多糖已作為穩(wěn)定劑、增稠劑被用于酸奶、奶酪等發(fā)酵奶制品的生產(chǎn)中[10]。

EPS的生物合成因菌種不同而發(fā)生在生長(zhǎng)的不同階段和環(huán)境條件下，按合成位點(diǎn)和合成模式的不同，EPS分為位于細(xì)胞壁外合成的同型多糖與位于細(xì)胞膜上合成的異型多糖，分子質(zhì)量在4.0×104～6.0×106Da[11]。同型多糖的合成為不依賴C55-lipid-pp的合成模式，異型多糖的合成則為依賴C55-lipid-pp的合成模式[12]。近幾十年來，由于微生物EPS在產(chǎn)品結(jié)構(gòu)、性能及生產(chǎn)方面所具有的特別優(yōu)勢(shì)而得到大力研究和開發(fā)，新的微生物EPS的開發(fā)已成為工業(yè)微生物研究的熱點(diǎn)之一[13]。然而國(guó)內(nèi)眾多學(xué)者對(duì)EPS的研究，主要集中在真菌多糖（如靈芝多糖、蟲草多糖和香菇多糖等[14]）。LAB作為食品級(jí)工業(yè)生產(chǎn)菌，與其他微生物相比安全性高。隨著對(duì)LAB研究的不斷深入，LAB EPS因具有益生功能逐漸引起研究者的關(guān)注[3]，然而EPS產(chǎn)量低，菌株穩(wěn)定性差，是制約其大規(guī)模生產(chǎn)的主要因素[15]。此外，由于LAB對(duì)生長(zhǎng)條件較為苛刻，培養(yǎng)基成分較為復(fù)雜，發(fā)酵條件的微小改變都會(huì)顯著影響EPS的產(chǎn)量。

本課題組之前從東北自然酸菜發(fā)酵液中分離得到多株高產(chǎn)EPS的LAB，通過一系列生物化學(xué)方法鑒定其種屬地位，并利用單因素試驗(yàn)考察了培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件對(duì)EPS產(chǎn)量的影響。本研究為了提高目標(biāo)菌株的EPS產(chǎn)量，滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面法優(yōu)化菌株產(chǎn)EPS能力，并探索其抗氧化性質(zhì)，為該EPS的分離純化奠定基礎(chǔ)，為益生元特性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）TD1：分離自東北自然發(fā)酵酸菜樣品。葡萄糖、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、K2HPO4、無水乙酸鈉、檸檬酸銨、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、吐溫80、硫酸、苯酚、乙醇、三氯乙酸、過硫酸鉀、鄰苯三酚、水楊酸、亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺等（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖80 g/L，酵母提取物8 g/L，牛肉膏12 g/L，蛋白胨12 g/L，無水乙酸鈉6 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·H2O 0.25 g/L，檸檬酸銨2 g/L，吐溫80 1 mL/L，121℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；5804R型離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；DHP-420電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；SPX-100B-D振蕩培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；FE20 pH計(jì)：梅特勒-托利多（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 EPS的提取

取500 mL發(fā)酵液，于4 ℃、4 000×g條件下離心60 min，取上清。上清液加入3倍體積的預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，醇沉過夜，4℃、12000×g離心40min收集多糖沉淀，用250mL超純水30～40℃溶解多糖沉淀，加入250mL 10%三氯乙酸，充分?jǐn)嚢?℃靜置10 h，4℃、12 000×g離心40 min收集上清液。隨后再次加入3倍體積的預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，醇沉過夜，4℃、12 000×g離心40 min收集多糖沉淀，重溶于超純水中，裝入透析袋（截留分子量14 000 Da）中，4℃透析2 d，每8 h換一次水。

1.3.2 EPS含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定EPS的含量，將1 mL EPS樣品與1 mL體積分?jǐn)?shù)6%的苯酚溶液、5 mL濃硫酸溶液混勻，靜置冷卻至室溫后，于波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度值。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算EPS的含量。

1.3.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)是響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的一種，用于中心組合試驗(yàn)之前挑選優(yōu)化因素的一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。依據(jù)DU RP等[17]的方法，選擇影響EPS產(chǎn)量的10個(gè)因素蔗糖（X1）、蛋白胨（X2）、Ca2+濃度（X3）、酵母提取物（X4）、無水乙酸鈉（X5）、牛肉膏（X6）、初始pH值（X7）、裝液量（X8）、搖床轉(zhuǎn)速（X9）、培養(yǎng)溫度（X10），以EPS產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，選取N=12的PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響EPS產(chǎn)量的10個(gè)因素的顯著性進(jìn)行考察，將每個(gè)因素分為高（+1）、低（-1）2個(gè)水平。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 兩水平析因試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of factorial tests with two levels

1.3.4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)PB試驗(yàn)的結(jié)果，以EPS產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，對(duì)EPS產(chǎn)量的影響因素蔗糖（X1）、Ca2+濃度（X3）、無水乙酸鈉（X5），進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，得到最優(yōu)方案。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表2。

表2 菌株TD1產(chǎn)胞外多糖條件優(yōu)化中心組合設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of central composite design for the conditions optimization of EPS production by strain TD1

1.3.5 測(cè)定方法

超氧陰離子自由基清除率：按照參考文獻(xiàn)[18]的方法測(cè)定；羥基自由基清除率：按照參考文獻(xiàn)[19]的方法測(cè)定；DPPH自由基清除率：按照參考文獻(xiàn)[20]的方法測(cè)定。NO2-清除率：按照參考文獻(xiàn)[21]的方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌Leu.citreum TD1培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.1.1 顯著因素篩選結(jié)果

在對(duì)Leu.citreum TD1產(chǎn)EPS單因素條件研究基礎(chǔ)上，通過兩水平析因設(shè)計(jì)篩選對(duì)產(chǎn)EPS影響顯著的因素，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，回歸分析結(jié)果見表4。

表3 兩水平析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of factorial design tests with two levels

表4 兩水平析因設(shè)計(jì)回歸分析結(jié)果Table 4 Regression analysis results of factorial design with two levels

由表3、表4可知，兩水平析因試驗(yàn)?zāi)Ｐ晚?xiàng)顯著（P=0.0436＜0.05），R2=0.954 7，調(diào)整R2=0.996 5，二者均接近1，信噪比=49.804（＞4），表明模型能夠很好的擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)。各變量對(duì)響應(yīng)值影響顯著程度依次為X1＞X5＞X3＞X6＞X4＞X7＞X8＞X9＞X2＞X10，即蔗糖（X1）、Ca2+濃度（X3）和無水乙酸鈉（X5）對(duì)Leu.citreum TD1產(chǎn)EPS有顯著影響（P＜0.05）。其他變量在本研究條件下對(duì)發(fā)酵液EPS含量無顯著影響。

模型擬合方程為TD1 EPS含量=19.893 33+0.503 83X1-0.062 500X2-1.181 67X3+1.267 50X4+3.336 67X5-30.833 33X6-1.233 33X7+0.110 00X8+0.361 67X9+0.034 667X9。

2.1.2 顯著因素水平優(yōu)化結(jié)果

菌株TD1產(chǎn)胞外多糖條件優(yōu)化中心組合試驗(yàn)結(jié)果見表5，回歸分析見表6。

表5 菌株TD1產(chǎn)胞外多糖條件優(yōu)化中心組合試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of central composite tests for the conditions optimization of EPS production by strain TD1

表6 中心組合設(shè)計(jì)回歸分析結(jié)果Table 6 Regression analysis results of center composite design

由回歸分析（表6）可知，模型項(xiàng)極顯著（P＜0.000 1＜0.05），失擬合項(xiàng)不顯著（P=0.372 0＞0.05），R2=0.948 4，調(diào)整R2=0.902 0，信噪比=33.810（＞4），表明模型能夠很好的擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)。X5、X1X3、X1X5、X3X5對(duì)產(chǎn)EPS無顯著影響（P＞0.05）；X52對(duì)產(chǎn)EPS有顯著影響（P＜0.05）；X1、X3、X12、X32對(duì)產(chǎn)EPS有極顯著影響（P＜0.01）。

各因素及交互作用對(duì)Leu.citreum TD1產(chǎn)EPS影響如圖1所示。

圖1 顯著影響Leuconostoc citreum TD1產(chǎn)EPS的各因素交互作用響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots of interaction of each factors significantly affecting the EPS production by Leuconostoc citreum TD1

模型擬合方程為：TD1 EPS含量（g/L）=4.83-4.83X1+0.94X3-0.36X5-1.12X1X3-4.06X1X5-0.34X3X5-6.61X12-1.89X32-1.82X52。式中二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值，可知方程有極大值，擬合曲面開口朝下。預(yù)測(cè)蔗糖為108.99 g/L、Ca2+濃度為0.21 mmol/L、無水乙酸鈉為6.66 g/L時(shí)，TD1 EPS含量達(dá)到最大值56.60 g/L。

2.1.3 最優(yōu)產(chǎn)TD1 EPS條件驗(yàn)證結(jié)果

為方便實(shí)際操作，修改培養(yǎng)條件為蔗糖為109 g/L、Ca2+濃度為0.2 mmol/L、無水乙酸鈉為6.7 g/L，在此條件下，TD1 EPS含量為（57.58±2.04）g/mL，與預(yù)測(cè)值56.60 g/L無顯著差異（P＞0.05），即中心組合試驗(yàn)優(yōu)化模型擬合性良好，結(jié)果可靠。本研究中響應(yīng)面法優(yōu)化后，Leu.citreum TD1產(chǎn)EPS水平是優(yōu)化前（32.71 U/mL）的1.76倍。

2.2 供試菌Leu.citreum TD1 EPS抗氧化作用

2.2.1 對(duì)O2-·的清除作用

圖2 EPS對(duì)O2-·的清除曲線Fig.2 Scavenging curve of EPS to O 2-·

由圖2可知，隨著TD1 EPS和維生素C（vitamin C，VC）質(zhì)量濃度的增大，清除率呈現(xiàn)先急速升高后保持平穩(wěn)的趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度＞0.063 2 mg/mL時(shí)，清除率提高幅度明顯減小，在質(zhì)量濃度為0.252 6 mg/mL時(shí)，TD1 EPS和VC對(duì)O2-·的清除率達(dá)到最大，分別為（55.23±2.18）%和（87.72±1.71）%。研究表明，O2-·是一種較弱的氧化劑，在機(jī)體中可以通過歧化作用等其他反應(yīng)產(chǎn)生過氧化物和羥自由基，從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定損傷[22]。戚躍明等[23]研究EPS對(duì)O2-·清除能力發(fā)現(xiàn)，在質(zhì)量濃度為10mg/mL時(shí)，O2-·清除率達(dá)到47.4%，顯著低于本研究中的EPS清除效率（P＜0.05）。由此可以看出，TD1 EPS對(duì)O2-·具有一定的清除活性，其作為添加劑可以降低機(jī)體的損傷程度。

2.2.2 對(duì)·OH的清除作用

圖3 EPS對(duì)·OH的清除曲線Fig.3 Scavenging curve of EPS to·OH

由圖3可知，隨TD1 EPS和VC質(zhì)量濃度的增加，·OH的清除率呈現(xiàn)先升高后趨于平緩的趨勢(shì)。在質(zhì)量濃度為0～0.5mg/mL時(shí)，VC對(duì)·OH的清除率始終高于TD1EPS對(duì)·OH的清除率，而質(zhì)量濃度在0.5～1.0mg/mL時(shí)，TD1EPS對(duì)·OH的清除率要高于VC對(duì)·OH的清除率。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.0mg/mL時(shí)，二者對(duì)·OH的清除率分別達(dá)到（95.34±2.33）%（EPS）和（90.76±2.98）%（VC）。崔靜等[24]發(fā)現(xiàn)ESP6對(duì)·OH具有明顯的清除作用，在質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，清除率高達(dá)91.5%，顯著低于本研究中TD1 EPS對(duì)·OH的清除作用。

2.2.3 對(duì)DPPH自由基的清除作用

圖4 EPS對(duì)DPPH自由基的清除曲線Fig.4 Scavenging curve of EPS to DPPH radicals

由圖4可知，隨TD1 EPS和VC質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率逐漸上升，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。當(dāng)EPS和VC的質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率分別達(dá)到（56.61±3.09）%和（87.54±2.17）%。而相較于VC，TD1 EPS的DPPH自由基清除率相對(duì)較弱。DPPH是一類較為穩(wěn)定的合成自由基，其穩(wěn)定性主要源于共振穩(wěn)定作用及苯環(huán)的空間障礙作用。若能將DPPH清除，則表明受試化學(xué)物質(zhì)具有較強(qiáng)的自由基清除能力。張玉龍等[25]研究不同種類ESP對(duì)DPPH的清除能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ESP質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH的清除率為33.53%～41.92%，低于本研究中EPS對(duì)DPPH自由基清除率。TD1 EPS具有DPPH自由基有清除能力可能是由于多糖中的羥基具有供氫質(zhì)體能力的結(jié)果。

2.2.4 對(duì)NO2-的清除作用

圖5 EPS對(duì)NO2-的清除曲線Fig.5 Scavenging curve of EPS to NO 2-

硝酸鹽在酸性條件下可轉(zhuǎn)變成的亞硝酸，亞硝酸具有較強(qiáng)的氧化性，可將血液中的二價(jià)鐵離子氧化成三價(jià)鐵離子，進(jìn)而使血紅蛋白轉(zhuǎn)變成高鐵血紅蛋白，失去結(jié)合氧的能力，從而引起組織缺氧，急性中毒[26]。此外，亞硝酸可與胺類物質(zhì)反應(yīng)，生成具有強(qiáng)致癌作用的亞硝基胺類化合物，誘發(fā)人消化道癌等疾病。尤其是在發(fā)酵食品中，亞硝酸鹽的控制十分重要。大量研究表明，在食品（如酸菜）發(fā)酵過程中添加VC，可以有效地降解亞硝酸鹽，提高發(fā)酵制品的安全性[27]。由圖5可知，在濃度較低的情況下，NO2-的清除率與TD1 ESP濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，但清除率均小于VC。在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，NO2-的清除率分別為（5.32±0.18）%（TD1 EPS）和（10.89±2.11）%（VC）。之后，隨著濃度的升高，NO2-的清除率升高較為緩慢。因此可以看出，TD1 EPS對(duì)亞硝酸鹽具有一定的清除能力，在作為添加劑替代VC用于食品發(fā)酵上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究以Leu.citreum TD1為供試菌株，采用響應(yīng)面方法通過三步試驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)化菌株產(chǎn)EPS條件。首先，兩水平析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果表明，蔗糖、Ca2+和無水乙酸鈉對(duì)Leu.citreum TD1產(chǎn)EPS有顯著影響。然后，中心組合設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)培養(yǎng)基中蔗糖為109 g/L、Ca2+為0.2 mmol/L和無水乙酸鈉為6.7 g/L時(shí)，EPS含量達(dá)到最大值56.60 g/L。在此優(yōu)化條件下，TD1 EPS含量為（57.58±2.04）g/L，是優(yōu)化前（32.71 g/L）的1.76倍。TD1 EPS對(duì)超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基和NO2-均具有良好的抗氧化活性，清除效率隨著濃度的增加而增強(qiáng)，最高分別為（55.23±2.18）%、（95.34±2.33）%、（56.61±3.09）%和（5.32±0.18）%。因此，Leu.citreum TD1發(fā)酵得到的EPS作為天然抗氧化劑具有廣闊的應(yīng)用和開發(fā)前景。