童 星，彭 勃

（1.佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司，廣東 佛山 528000；2.佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000；3.廣東海天創(chuàng)新技術(shù)有限公司，廣東 佛山 528000）

醬油是以大豆、面粉等糧食作為主要原料，經(jīng)微生物發(fā)酵釀造而成的具有獨特風(fēng)味的傳統(tǒng)調(diào)味品。目前，我國醬油每年生產(chǎn)量超過600萬t[1]。制曲在我國傳統(tǒng)醬油釀造食品的生產(chǎn)工藝中廣泛使用[2]，在制曲過程中，米曲霉（Aspergillus oryzae）、酵母等多種微生物的生長，使原料被分解，對醬油的風(fēng)味和品質(zhì)的提高具有重要意義[3]。米曲霉是醬油發(fā)酵過程中起主要作用的微生物，在發(fā)酵過程中可以通過分解淀粉和蛋白質(zhì)原料，為其他微生物的代謝作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)[4]，同時形成的小分子多肽和氨基酸類物質(zhì)也是醬油中風(fēng)味物質(zhì)形成的前提[5]。

目前，國內(nèi)醬油生產(chǎn)用米曲霉菌株都有獨立的發(fā)酵特性，在生長速度、產(chǎn)孢數(shù)及主要酶系的分布等方面都有較為顯著的差異[6]。米曲霉滬釀3.042是國內(nèi)醬油廠家廣泛使用的發(fā)酵菌種，具有生產(chǎn)周期短、抗性好、管理粗放等優(yōu)點，為了獲得更高的產(chǎn)量，對該菌種的最佳產(chǎn)酶條件[7]和菌株改造[8]進行研究。雖然篩選出的新菌株的蛋白酶活越來越高，但同時也打破了該菌株原來的酶系分布，而醬油釀造是一個多酶系共同作用的過程，酶系的改變?nèi)菀自斐衫眉兦咕臧l(fā)酵出的醬油質(zhì)量下降[9]。因此，可以通過多菌種混合發(fā)酵[10-11]、發(fā)酵過程加酶處理或菌種改良等方法解決，但因多菌種混合發(fā)酵過程中多菌株的競爭性生長、發(fā)酵過程中加酶處理引入外源物質(zhì)，容易造成成本的增加和食品安全隱患。因此，只有通過菌種改良，選育出綜合酶活力高、制曲過程原料消耗少的菌株，才能從根本上提高醬油生產(chǎn)時發(fā)酵原油的品質(zhì)。

本研究通過常壓室溫等離子體（atmospheric roomtem-peratureplasma，ARTP）對米曲霉菌株As3.951進行誘變，篩選一株高酶活力的誘變菌株應(yīng)用于醬油釀造，提高醬油品質(zhì)，節(jié)省原料，為釀造醬油品質(zhì)的提升提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌種

米曲霉（Aspergillus oryzae）As3.951：佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

酪蛋白培養(yǎng)基：干酪素6 g，KH2PO40.36 g，Na2HPO40.58 g，MgSO40.244 g，瓊脂粉20 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，pH 6.0，121℃滅菌15 min。

大豆蛋白培養(yǎng)基：大豆分離蛋白10g，MgSO4·7H2O0.5g，木糖30g，KH2PO41 g，瓊脂粉15 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，pH 6.4，121℃滅菌15min。

制曲培養(yǎng)基：麩皮200 g，豆粉200 g，面粉50 g，蒸餾水550 g，混合均勻后121℃滅菌15 min。

豆汁培養(yǎng)基：葡萄糖30 g，酵母膏20 g，瓊脂20 g，豆汁（100 g黃豆，用1 000 mL蒸餾水浸泡24 h，煮沸30 min，過濾，取汁定容至1 000 mL）100 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，混勻，pH自然，121℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂（均為分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；木糖（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；干酪素（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉（生化試劑）：上海環(huán)凱微生物科技有限公司；大豆分離蛋白（生化試劑）：日本和光純藥工業(yè)株式會社；大豆、麩皮、面粉（均為食品級）：佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-250型生化培養(yǎng)箱：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；BX53型光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS公司；759S型紫外分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種誘變

（1）取米曲霉As3.951菌株的成熟斜面孢子制成孢子懸液，濃度為1×108CFU/mL，并對孢子懸液進行ARTP誘變。用0.85%的無菌生理鹽水將誘變后的孢子懸液梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，制成孢子稀釋液。

（2）取0.2mL孢子稀釋液涂布于酪蛋白培養(yǎng)基平板上，31℃避光培養(yǎng)96 h。

（3）挑取與出發(fā)菌種As3.951相比具有菌絲生長旺盛、透明圈大、產(chǎn)孢時間延遲特點的單菌落劃線于大豆蛋白培養(yǎng)基上，31℃條件下培養(yǎng)60h，再次挑取與出發(fā)菌種As3.951相比菌落直徑大、菌絲生長旺盛的單菌落，轉(zhuǎn)接于大豆蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)，成熟后進行菌種保藏。

1.3.2 誘變菌株篩選

（1）誘變菌株的初篩

將誘變獲得的目標(biāo)菌種轉(zhuǎn)接于大豆蛋白培養(yǎng)基斜面上活化，30℃培養(yǎng)4 d。刮取斜面上孢子至無菌水中，使最終孢子濃度為1×108CFU/mL，按接種量為制曲培養(yǎng)基質(zhì)量的10%分別接種于制曲培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑選菌絲生長和孢子著生正常的菌株制曲，并對制曲完成后的成熟曲料進行質(zhì)量分析（孢子數(shù)、中性蛋白酶活力、淀粉酶活力），優(yōu)選生長正常和綜合酶活力高的菌株進行復(fù)篩。

（2）誘變菌株的復(fù)篩

將初篩獲得的菌株依次轉(zhuǎn)接斜面活化后，進行三角瓶擴大培養(yǎng)，然后繼續(xù)進行制曲和發(fā)酵試驗。通過檢測成曲（孢子數(shù)、原料消耗率、中性蛋白酶、谷氨酰胺酶和淀粉酶酶活）以及發(fā)酵原油（氨基酸態(tài)氮、全氮、全氮收得率、還原糖、谷氨酸）的質(zhì)量，優(yōu)選出最佳菌株。

1.3.3 菌落形態(tài)觀察

挑取最優(yōu)菌株的單菌落接種于豆汁培養(yǎng)基平板，于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 h后，觀察菌落生長狀態(tài)。

1.3.4 成曲及原油制備工藝

成曲制備工藝[2]：將大豆?jié)櫵铀繛榇蠖官|(zhì)量的1.2倍，115℃蒸料15 min。熟料快速冷卻至37～40℃，拌入30%的面粉，按原料質(zhì)量接入0.15%菌種，拌勻。按照通風(fēng)制曲培養(yǎng)方式進行培養(yǎng)，溫度控制在30～35℃，培養(yǎng)42 h后制曲結(jié)束，獲得成曲。

原油制備工藝[12]：采用我國傳統(tǒng)高鹽稀態(tài)發(fā)酵法。4 kg成熟曲料與8 kg鹽水（18%）均勻混合，于30℃條件下恒溫發(fā)酵50 d，過濾去除醬醪得到原油。

1.3.5 選育菌株醬油生產(chǎn)效果驗證

將誘變篩選的新菌株與出發(fā)菌株同步應(yīng)用于醬油生產(chǎn)的制曲及發(fā)酵階段。制曲結(jié)束后抽樣檢測成曲的孢子數(shù)、原料消耗率、中性蛋白酶活力、淀粉酶活力及谷氨酰胺酶活力，發(fā)酵結(jié)束后檢測原油的氨基酸態(tài)氮、全氮、全氮收得率、還原糖及谷氨酸含量，并對原油進行感官評定。

1.3.6 指標(biāo)測定

孢子數(shù)測定采用顯微鏡計數(shù)法[13]；全氮含量的的測定采用凱氏定氮法[14]；全氮收得率=原油全氮（g/100 mL）/原料全氮（g/100mL）×100%；氨基酸態(tài)氮含量的測定采用GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中甲醛滴定法；中性蛋白酶活力的測定按照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》；淀粉酶活力的測定按照GB/T 5521—2008《糧油檢驗谷物及其制品中α-淀粉酶活性的測定比色法》；還原糖含量的測定按照GB/T 5009.7—2003《食品中還原糖的測定》；谷氨酰胺酶活力的測定參照鄒敏娟等[15]的方法。

感官評定[16]：隨機選出30人組成感官評定小組，對使用菌株As3.951和ZA189釀造的原油進行品鑒，并針對色澤、香氣、鮮味、甜味、苦澀味、鮮味、酸味、綜合口感以及體態(tài)進行比較及打分，評分范圍為1～5分（滿分為5分），分?jǐn)?shù)越高表示喜愛度越高，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見文獻[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

2.1.1 初篩菌株成曲質(zhì)量分析

挑選菌絲生長和孢子著生正常的菌株ZA189、ZA191、ZA192、ZA193、ZA194分別制曲，并對成曲質(zhì)量進行分析，結(jié)果見表1。

由表1可知，通過誘變獲得的5株菌株的成曲質(zhì)量與米曲霉As3.951相比，孢子數(shù)均降低；中性蛋白酶活力均提高，其中菌株ZA192成曲的中性蛋白酶活力最高，為3158.64U/g；除菌株ZA193（416.53 U/g）外，其他菌株的淀粉酶活力均高于出發(fā)菌株As3.951。因此，優(yōu)選生長正常和綜合酶活力高的菌株ZA189、ZA191、ZA192、ZA194進行復(fù)篩。

表1 初篩菌株成曲的質(zhì)量分析Table 1 Quality analysis of finished kojimade with initial screening strains

2.1.2 復(fù)篩菌株的成曲質(zhì)量分析

采用初篩獲得的4株誘變菌株（ZA189、ZA191、ZA192和ZA194）制曲和發(fā)酵。檢測成曲及發(fā)酵原油的質(zhì)量，結(jié)果分別見表2和表3。

表2 復(fù)篩菌株成曲的質(zhì)量分析Table 2 Quality analysis of finished kojiwith rescreening strains

由表2可知，4株誘變菌株中，菌株ZA189的孢子數(shù)較少，為2.18×108CFU/g，原料消耗率（5.79%）最低，而谷氨酰胺酶活力最高（3.43 U/g）；菌株ZA192的中性蛋白酶活力和淀粉酶活力最高，分別為3 210.07 U/g和525.80 U/g，但其谷氨酰胺酶活力低于菌株ZA189；菌株ZA191和ZA192在所有指標(biāo)中未見明顯優(yōu)勢。

表3 復(fù)篩菌株發(fā)酵原油的質(zhì)量分析Table 3 Quality analysis of crude soy sauce fermented with rescreening strains

由表3可知，復(fù)篩菌株發(fā)酵得到的原油的質(zhì)量指標(biāo)中，菌株ZA189的全氮收得率、還原糖和谷氨酸含量均高于其他3種菌株。綜合成曲和發(fā)酵原油質(zhì)量分析結(jié)果，米曲霉誘變菌株ZA189為最優(yōu)菌株。

2.2 米曲霉菌株ZA189的菌落形態(tài)

米曲霉誘變菌株ZA189在豆汁培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖1所示。

米曲霉孢子數(shù)和菌絲的生長旺盛程度與醬油制曲的效果直接相關(guān)，張賀迎等[17]認(rèn)為，大量孢子不利于蛋白酶活力的提高。

由圖1可知，米曲霉誘變菌株ZA189的菌落在豆汁培養(yǎng)基上生長快，培養(yǎng)60h后，成熟菌落形態(tài)單薄，直徑達38mm，色澤青黃綠色，幾乎無明顯菌絲，透明圈清晰，菌落表層覆蓋孢子厚度為（1.0±0.1）mm，而醬油生產(chǎn)用米曲霉孢子厚度在0.5～1.5mm范圍內(nèi)[18]。因此該菌株孢子著生適量，適宜用于醬油生產(chǎn)中。

圖1 菌株ZA189的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain ZA189

2.3 選育菌株ZA189釀造醬油過程指標(biāo)分析

2.3.1 菌株ZA189成曲質(zhì)量分析

采用誘變篩選的新菌株ZA189與出發(fā)菌株As3.951同步制曲，制曲結(jié)束后抽樣檢測曲料的各項指標(biāo)，結(jié)果見表4。

由表4可知，在制曲過程中，菌株ZA189的孢子數(shù)和原料消耗率顯著低于出發(fā)菌株As3.951（P＜0.05），酶活力明顯提高，中性蛋白酶活力和淀粉酶活力分別達到3 210.21 U/g和480.29 U/g，谷氨酰胺酶活力達到3.48 U/g，較出發(fā)菌株提高38%。米曲霉的谷氨酰胺酶活性能夠直接影響釀造醬油中的谷氨酸含量[19]，因此谷氨酰胺酶活力的提高對醬油鮮味的增加具有直接關(guān)聯(lián)。

表4 菌株ZA189與出發(fā)菌株As3.951成曲質(zhì)量的比較Table 4 Quality comparison of finished kojimade with strain ZA189 and starting strain As3.951

2.3.2 菌株ZA189發(fā)酵原油質(zhì)量分析

將制曲完成后的曲料進行發(fā)酵，并檢測經(jīng)發(fā)酵壓榨后原油的各項理化指標(biāo)，結(jié)果如表5所示。

由表5可知，選育菌種ZA189發(fā)酵原油的氨基酸態(tài)氮含量為1.16 g/100 mL、全氮含量為1.94 g/100 mL、還原糖含量為11.05 g/100 mL、谷氨酸含量為13.69 g/kg，均高于出發(fā)菌株As3.951，表明采用該選育菌株發(fā)酵原油的品質(zhì)明顯提高。

表5 菌株ZA189與出發(fā)菌株As3.951發(fā)酵原油質(zhì)量對比Table 5 Quality comparison of crude soy sauce fermented with strain ZA189 and starting strain As3.951

2.3.3 發(fā)酵原油的感官評定

將原油加熱處理后，對原油進行感官鑒評，結(jié)果見圖2。

圖2 原油的感官評定Fig.2 Sensory evaluation of crude soy sauce

由圖2可知，相比出發(fā)菌株米曲霉As3.951，菌株ZA189所得原油味道更濃郁，色澤更鮮明，具備醬香濃郁、鮮甜突出、滋味醇厚持久的特征，綜合口感達到3.66分，高于米曲霉As3.951（3.21分）。

3 結(jié)論

本研究采用ARTP對米曲霉As3.951進行誘變，選育出一株高酶活誘變菌株ZA189，與對照菌株As3.951相比，該菌株成曲的中性蛋白酶、淀粉酶和谷氨酰胺酶3種酶活力均得到明顯增強，分別為3 210.21 U/g、4 80.29 U/g、3.48 U/g，同時孢子數(shù)減少，原料消耗率下降，能夠改善現(xiàn)有米曲霉菌株普遍存在的主要問題；利用該菌株發(fā)酵得到的原油中氨基酸態(tài)氮、全氮、還原糖及谷氨酸含量增加，分別為1.17 g/100 mL、1.94 g/100 mL、11.05 g/100 mL和13.69 g/kg；菌株ZA189發(fā)酵得到的原油味道濃郁、色澤鮮明，能夠明顯提升釀造醬油發(fā)酵品質(zhì)，對釀造醬油的發(fā)展具有積極意義。