尚雪嬌，代程洋，王玉榮，廖 華，張振東，郭 壯，3*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.恩施市農(nóng)業(yè)局，湖北 恩施 445000；3.恩施市公共檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000）

恩施土家苗族自治州是由齊躍、巫山和武陵山脈等組成的山地，全州水資源豐富、森林覆蓋率高達71.2%，境內(nèi)生活著漢族、土家族和苗族等27個民族，有著制作和食用發(fā)酵蔬菜的習俗[1-2]。該地生產(chǎn)的腌菜主要以芥菜為原料，采用傳統(tǒng)手工技術(shù)將芥菜頭和部分芥菜葉露天晾曬至七成干后切丁、加適量鹽入壇腌漬而成。特殊的地理環(huán)境、開放的生產(chǎn)條件以及傳統(tǒng)的制作技術(shù)使得腌菜成品中保留了多種由環(huán)境和原料等因素引入的微生物。近年來研究人員對腌菜的微生物多樣性進行了初步解析，張奶英等[3]采用變性梯度凝膠電泳技術(shù)（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）對四川葉用芥菜鹽漬過程中微生物多樣性進行了研究，發(fā)現(xiàn)其中優(yōu)勢菌為鹽單胞菌（Halomonas sp.）、釀酒酵母（Saccharomy cerevisiae）和粘性紅圓酵母（Rhodotorulamucilaginosa）；鄧元源等[4]從福建省農(nóng)家自制腌菜中分離出3株乳酸菌，經(jīng)鑒定分別為短乳桿菌（Lactobacillusbrevi）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillusfermentum）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；林親錄等[5]從湖南省傳統(tǒng)發(fā)酵芥菜中分離出10株乳酸菌菌株，通過初步鑒定將其鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillus），然而目前關(guān)于恩施地區(qū)腌菜中微生物多樣性的研究報道尚少。

高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing，HTS）具有操作簡單、通量高和檢測速度快的特點，且一次可對多個樣本進行平行分析[6]，但因擴增引物通用性高，導(dǎo)致專門針對某一個種屬的微生物群落進行研究時其適用性較差[7]。在使用種屬特異性引物擴增16SrRNA多變區(qū)基因序列的基礎(chǔ)上，使用DGGE技術(shù)可以完成腸道等復(fù)雜基質(zhì)中乳酸菌菌群群落結(jié)構(gòu)的研究工作[8]，具有操作簡單易行、靈敏度高和可檢測到一個核苷酸水平的差異等優(yōu)點[9]。由此可見，將高通量測序和DGGE技術(shù)相結(jié)合進行發(fā)酵食品多樣性解析是可行的，且在窖泥[10]、豆醬[11]和腸道[12]細菌多樣性解析方面已得到了廣泛應(yīng)用。

因此，本研究采用MiSeq高通量測序與DGGE指紋圖譜技術(shù)相結(jié)合的方法對采集自恩施土家苗族自治州的腌菜中細菌多樣性進行了分析，并采用稀釋涂布平板法對其中所含乳酸菌進行了分離鑒定與保藏，為后續(xù)腌菜的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供菌株支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

腌菜樣品：采自恩施舞陽壩菜市場，3份，編號分別為YC01、YC02和YC03，每份分裝兩管。

1.1.2 試劑

聚丙烯酰胺、尿素、N,N-亞甲基二丙烯酰胺、四甲基乙二胺、過硫酸銨、乙醇、冰醋酸、甲醛、硝酸銀、碳酸鈣、丙三醇、過氧化氫、三氯甲烷、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、乙酸鈣、十二烷基硫酸鈉、酚、氯仿、異戊醇、醋酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Axygen清潔試劑盒：北京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；溶菌酶（400 U/μg）、蛋白酶K（20 U/μg）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP）mix、10×聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechain reaction，PCR）Buffer、r Taq酶（5 U/μL）、pMD18-T vector、Solution I：寶生物工程（大連）有限公司；10×Loading buffer、DL2000 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；2×PCRmix：南京諾唯贊生物科技有限公司；QIAGENDNeasymericon Food Kit提取試劑盒：德國QIAGEN公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 引物

高通量測序引物：正向引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）；反向引物806R（5′-GGACTACHVGGGT-3′）。

帶有GC夾子的PCR-DGGE正向引物Lac-GC-V3F（5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCACCGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′），不帶GC夾子的PCR-DGGE正向引物Lac-V3F（5′-ACCGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′）和PCR-DGGE反向引物Lac-V3R（5′-GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′）。

乳酸菌PCR擴增引物：正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）；反向引物1495R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）。

驗證陽性克隆引物：正向引物M13F（5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′）；反向引物M13R（5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′）。

以上引物均由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

VeritiTM96孔梯度PCR擴增儀：美國AB公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；DYY-12水平電泳儀：北京市六一儀器廠；DCodeTM System、UV PCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國BIO-RED公司；Bio-5000 plus掃描儀：上海中晶科技有限公司；DG250厭氧工作站：英國DWS公司；5810R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；ECLIPSECi生物顯微鏡：日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取

使用DNA提取試劑盒，按照試劑盒使用說明提取樣品基因組DNA，然后用微量紫外分光光度計檢測其濃度和純度。

1.3.2 細菌多樣性分析

PCR擴增及測序：PCR擴增16SrRNA V3-V4區(qū)。PCR擴增體系為5×FastPfu Buffer 4.0 μL，2.5mmol/L dNTPmix 2.0μL，5μmol/L的正（338F）反（806R）引物各0.8 μL，r Taq酶0.4μL，DNA模板10 ng，雙蒸水（ddH2O）補齊至20μL。PCR擴增程序為95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45 s，30次循環(huán)；72℃再延伸10 min[13]。擴增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行MiSeq高通量測序。

序列質(zhì)量控制：參照文獻[14]中的方法對下機后的序列進行拼接和質(zhì)量控制，對合格的序列進行下一步分析。

序列分析：參照CAPORASOJG等[15-16]的方法使用QIIME數(shù)據(jù)分析平臺對質(zhì)控后的序列分別以100%和97%的相似度進行序列劃分，從每個操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）中選擇一條代表性序列與Greengenes和RDP數(shù)據(jù)庫進行比對，統(tǒng)計各分類水平信息。

1.3.3 乳酸菌指紋圖譜分析

PCR擴增：將各樣品基因組DNA質(zhì)量濃度稀釋至20 ng/μL。PCR擴增條件為10×PCRBuffer（含Mg2+）2.5μL，dNTPmix（2.5 mmol/L）2.0 μL，Lac-GC-V3F（10 μmol/L）和Lac-V3R（10μmol/L）各0.5μL，r Taq酶0.2μL，DNA模板0.5μL，用ddH2O將體系補齊至25μL[17]。PCR擴增程序為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃再延伸10 min[18]。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測是否擴增出目的條帶。

DGGE檢測：聚丙烯酰胺凝膠變性劑變性范圍為35%～52%，上樣量為10μL，待0.5×三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（trisbase-acetic acid-ethylenediamine tetra acetic acid，TAE）制成的緩沖溶液溫度升至60℃時，調(diào)節(jié)電壓120 V運行78 min，然后80 V維持13 h。電泳結(jié)束后，待緩沖溶液冷卻至室溫采用銀染法使凝膠顯色。

條帶回收測序：將顯色后的凝膠置于掃描儀上掃描成像，標記特征條帶并用手術(shù)刀切下分別置于無菌EP管中，添加50μL無菌超純水，4℃靜置過夜，然后進行PCR擴增，PCR擴增條件為2×PCRmix 12.5μL，引物Lac-V3F和Lac-V3R各0.5μL，DNA模板2.0μL，無菌超純水補齊至25μL。PCR擴增程序及檢測方法同方法1.3.3。參照樊哲新等[19]的方法對合格的PCR產(chǎn)物進行清潔、連接pMD18-T載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichiacoli）Top10以及鑒定陽性克隆。將陽性克隆寄至武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序。將測回的序列用DNAMAN軟件處理后置于美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上進行比對，選取同源性較高的菌株，利用MEGA軟件中的鄰近法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 乳酸菌的分離鑒定

分離：采用稀釋涂布平板法分別將3個樣品稀釋至10-6和10-7梯度，然后取100μL稀釋液涂布于含1.0%CaCO3的MRS瓊脂培養(yǎng)基上，置于厭氧工作站中，37℃培養(yǎng)48 h后，挑選周圍有透明圈的單菌落純化2～3代，鏡檢合格后甘油保藏。

鑒定：對分離出的菌株進行革蘭氏染色以及過氧化氫酶試驗；參照文獻[20]中的方法提取乳酸菌DNA，然后以提取的DNA為模板進行PCR擴增，擴增條件和程序以及鑒定方法同1.3.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌多樣性分析

2.1.1 序列豐富度分析

采用MiSeq高通量測序技術(shù)分析細菌多樣性時，在100%相似度下共測得42954條序列，平均每個樣品14318條序列；在97%的相似度下又可將這些序列劃分成4 347個OTU，現(xiàn)對平均相對含量＞0.1%的OTU進行分析，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，平均相對含量＞0.1%的OTU有36個，其中OTU1168、OTU1427和OTU4213的平均相對含量明顯高于其他OTU，且這3個OTU在腌菜樣品YC01中的相對含量分別為71.16%、7.55%和0.33%；在腌菜樣品YC02中的相對含量分別依次為68.40%、0和2.20%；在腌菜樣品YC03中的相對含量分別為53.19%、0.08%和1.46%。將OTU1168的代表性序列分別在Greengenes和RDP數(shù)據(jù)庫進行比對，均將該序列鑒定為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。由此可見，恩施地區(qū)腌菜樣品中存在大量共有細菌菌群，且乳酸桿菌可能為其優(yōu)勢細菌屬。

圖1 核心OTUs相對含量分析Fig.1 Relative abundance analysis of core OTUs

2.1.2 α多樣性分析

在測序深度為28910條序列的條件下，對腌菜樣品YC01、YC02和YC03進行α多樣性分析。YC01、YC02和YC03的超1（Chao1）指數(shù)分別為700、837和983，香農(nóng)（Shannon）指數(shù)分別為2.98、2.42和4.34，由此可見，腌菜樣品YC03中的細菌豐富度和多樣性要高于YC01和YC02。

2.1.3 優(yōu)勢菌相對含量分析

經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，3個腌菜樣品中共檢測到10個門、24個綱、43個目、72個科和120個屬的細菌，所有樣品僅有2.68%的序列不能鑒定到屬水平。將平均相對含量＞0.1%的細菌門定義為優(yōu)勢菌門，優(yōu)勢菌門在各樣品中的分布情況如圖2所示。

圖2 優(yōu)勢細菌門相對含量分析Fig.2 Relative abundance analysis of dominant bacteria phyla

由圖2可知，腌菜樣品中優(yōu)勢細菌門為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）。所有腌菜樣品中含量最高的均為Firmicutes，其平均相對含量達97.09%；其次為Proteobacteria，平均相對含量為2.02%。腌菜樣品YC01、YC02和YC03中鑒定出的細菌屬數(shù)量分別為54個、95個和73個，各樣品優(yōu)勢細菌屬的相對含量如圖3所示。

圖3 優(yōu)勢細菌屬相對含量分析Fig.3 Relative abundance analysis of dominant genus of bacteria

由圖3可知，平均相對含量＞0.1%的優(yōu)勢細菌屬有7個，即乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、弧菌屬（Vibrio）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和黃桿菌屬（Flavobacterium），其平均相對含量分別為82.37%、7.02%、5.38%、0.58%、0.27%、0.15%和0.14%。王一淇等[21]通過采用純培養(yǎng)計數(shù)的方法對湖南芥菜腌制發(fā)酵過程中的菌相變化規(guī)律進行了解析，結(jié)果表明，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）在芥菜自然發(fā)酵的中期和后期都占主要優(yōu)勢，這與本研究結(jié)果有相似之處。

2.2 乳酸菌指紋圖譜分析

經(jīng)高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus在樣品中的平均相對含量達82.37%，是恩施腌菜樣品中平均相對含量最高的細菌屬，本研究進一步采用DGGE指紋圖譜技術(shù)對樣品中Lactobacillus的種類及其在各樣品間的差異進行研究，結(jié)果如圖4所示。

圖4 乳酸菌的DGGE指紋圖譜Fig.4 DGGE fingerprint of lactic acid bacteria

由圖4可知，在DGGE指紋圖譜上每個樣品都檢測出數(shù)目不等的條帶。其中條帶LYC3和LYC4為腌菜樣品中共有條帶，而條帶LYC1為腌菜樣品YC03中特有條帶，條帶LYC5為腌菜樣品YC01中特有條帶，條帶LYC2為腌菜樣品YC01和YC03共有條帶，這說明恩施腌菜中含有多種共有乳酸桿菌，同時各樣品中也含有特有細菌菌群。腌菜樣品YC03泳道中的條帶數(shù)量及條帶明亮度高于腌菜樣品YC01和YC02泳道，說明腌菜樣品YC03中的乳酸菌的豐度較腌菜樣品YC01和YC02中的高，這與高通量測序結(jié)果一致。將回收條帶的測序結(jié)果與NCBI中的模式株比對，結(jié)果如表1所示。

表1 乳酸菌PCR-DGGE優(yōu)勢條帶比對結(jié)果Table 1 Comparison results of dominant band of lactic acid bacteria by PCR-DGGE

由表1所知，回收的優(yōu)勢條帶中有4條隸屬于乳酸桿菌屬，其中LYC1為清酒乳桿菌（L.sakei），LYC2為L.insicii，LYC3為L.plantarum subsp.argentoratensis，LYC4為植物乳桿菌植物亞種（L.plantarum subsp.plantarum），LYC5為耐酸乳桿菌（L.acetotolerans）。

2.3 乳酸菌的分離鑒定

通過稀釋涂布平板法從3個腌菜樣品中分離出15株菌，編號分別為YC01-1、YC01-2、YC01-3、YC01-4、YC02-1、YC02-2、YC02-3、YC02-4、YC02-5、YC03-1、YC03-2、YC03-3、YC03-4、YC03-5和YC03-6，經(jīng)生理生化試驗得出，15株菌株革蘭氏染色為陽性、過氧化氫酶試驗檢測為陰性，16SrRNA鑒定序列與最似模式菌菌株的相似度均在99%以上。乳酸菌菌株與模式株的進化關(guān)系如圖5所示。

圖5 乳酸菌基于16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria based on 16S rRNA sequences

由圖5可知，經(jīng)鑒定及比對發(fā)現(xiàn)這些菌株主要為植物乳桿菌（L.plantarum）、短乳桿菌（L.brevi s）、彎曲乳桿菌（L.curvatus）、消化乳桿菌（L.alimentarius）和清酒乳桿菌（L.sakei）。進一步對各菌株在樣品中的分布進行統(tǒng)計，結(jié)果如表2所示。

表2 各腌菜樣品中乳酸菌菌株的種類和數(shù)量Table 2 Species and quantities of lactic acid bacteria strains in each pickle sample

由表2可知，從腌菜樣品YC01共分離出4株乳酸菌，經(jīng)鑒定分別為L.plantarum、L.curvatus和L.brevi s；從腌菜樣品YC02中共分離出5株乳酸菌，經(jīng)鑒定分別為L.plantarum和L.sakei；從腌菜樣品YC03中分離出6株乳酸菌，經(jīng)鑒定分別為L.plantarum和L.alimentarius。由此可見，雖然Lactobacillus為腌菜樣品中的優(yōu)勢菌，但乳酸桿菌的構(gòu)成在樣品間存在一定的差異。值得一提的是，腌菜樣品YC02中的5株乳桿菌中有4株為L.sakei，有研究表明，該菌能產(chǎn)生多種細菌素，其中I類、部分IIa和IIb類清酒乳桿菌細菌素均具有一定的抑菌作用[22]，這可能是導(dǎo)致腌菜樣品YC02中細菌豐度低于其他樣品的原因之一。此外，采用傳統(tǒng)微生物學(xué)手段從樣品中分離出15株隸屬于5個種的乳酸菌，但未分離出DGGE檢測到的L.insicii和L.acetotolerans，這可能與微生物特殊生長需求以及培養(yǎng)條件的限制有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究采用MiSeq高通量測序和DGGE技術(shù)相結(jié)合的方法對采集自恩施地區(qū)的3份腌菜樣品中細菌多樣性進行了分析，MiSeq高通量測序結(jié)果表明，腌菜樣品中含量最高的優(yōu)勢細菌門為硬壁菌門（Firmicutes），優(yōu)勢細菌屬為Lactobacillus、Weissella、Leuconostoc、Vibrio、Pseudomonas、Psychrobacter和Flavobacterium，雖然Lactobacillus為恩施腌菜中的優(yōu)勢細菌屬且平均相對含量高達82.37%，但不同腌菜樣品間乳酸菌的種類存在較大差異。

DGGE測定結(jié)果表明，腌菜中含有L.sakei、L.insicii、L.plantarum subsp.argentoratensis、L.plantarum subsp.plantarum和L.acetotolerans。

經(jīng)稀釋涂布平板法從腌菜中共分離到15株乳酸菌，包括L.plantarum7株、L.alimentarius 2株、L.curvatus和L.brevi s各1株以及L.sakei4株。