由淑萍 張石蕾 趙 軍馬 龍劉 濤*

（1. 新 疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆 烏魯木齊830011；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)護理學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011；3. 新 疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004）

肝纖維化發(fā)生與發(fā)展的核心環(huán)節(jié)是肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)激活后的迅速增殖，分泌過量的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。本課題組前期研究結(jié)果表明[1-3]，肉蓯蓉苯乙醇總苷(phenylethanol glycosides from Cistanche tubulosa，CPhGs)對牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)所致的肝纖維化大鼠及HSC細胞的活化均具有顯著抑制作用，呈現(xiàn)出一定的抗肝纖維化及抗炎的生物活性。由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所植物化學(xué)室提取純化的CPhGs(純度為70%)，經(jīng)鑒定其主要成分為毛蕊花糖苷和松果菊苷，且毛蕊花糖苷誘導(dǎo)HSC細胞的凋亡最為顯著[4]。同時，文獻研究顯示，血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)是刺激HSC細胞最強的有絲分裂原，它有3種不同形式的二聚體：PDGF-AA、PDGFBB和PDGF-AB。目前認為，PDGF-BB是刺激HSC細胞活化，激活相關(guān)基因及蛋白的表達，對肝纖維化的形成最為有效的促有絲分裂因子。毛蕊花糖苷是否能夠參與PDGF-BB因子誘導(dǎo)的肝纖維化并調(diào)節(jié)及抑制HSC細胞的活化仍然值得繼續(xù)深入研究。本研究擬采用重組大鼠血小板衍生生長因子-BB(recombinant rat platelet derived growth factor-BB， rrPDGF-BB)刺 激HSC細胞，觀察不同濃度的毛蕊花糖苷對PDGF-BB因子誘導(dǎo)的HSC細胞增殖的抑制作用，及其對HSC細胞遷移能力和肝纖維化形成過程中的標(biāo)志性基因表達的影響，如HSC細胞活化標(biāo)志基因α-SMA、凋亡效應(yīng)分子caspase-3、最重要的促增殖和凋亡的MAPK信號通路中的關(guān)鍵基因ERK1/2、P-ERK1/2、Akt、P-Akt等，以探討毛蕊花糖苷對HSC細胞的調(diào)控作用及可能的作用機制，以期為抑制HSC細胞活化、尋找防止肝纖維化的新靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉蓯蓉苯乙醇總苷及毛蕊花糖苷，由新疆和田帝辰生物醫(yī)藥有限公司提供，以DMEM(高糖)完全培養(yǎng)液將毛蕊花糖苷配置成3種混懸液，濃度分別為1.5、3.0、6.0 mg/L；HSC細胞購自中國武漢普諾賽(Procell)公司；大鼠Ⅰ型膠原ELISA試劑盒(CUSABIO)購自武漢華美生物工程有限公司；重組大鼠PDGF-BB(rrPDGFBB)購自美國Peprotech公司；p44/42 MAPK(Erk1/2)、phospho-p44/42 MAPK(p-Erk1/2)、 Akt、 P-Akt抗 體 購自美國CST公司；α-SMA抗體購自美國Abam公司；caspase-3抗體、β-actin抗體購自中國武漢三鷹(Proteintech)公司。

1.2 HSC細胞培養(yǎng)及分組

HSC細胞分為5組[4]：對照組、PDGF-BB組、毛蕊花 糖 苷 (1.5、 3.0、 6.0 mg/L)組 。 將HSC細 胞 以 5×104/mL接種于6孔板，含10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，對照組不施加任何干預(yù)，PDGF-BB組僅用rrPDGF-BB刺激(10 ng/mL)，作用24 h。3個毛蕊花糖苷組均加入rrPDGF-BB(10 ng/mL)刺激24 h，再分別加入(1.5、3.0、6.0 mg/L)的毛蕊花糖苷處理。

1.3 劃痕實驗檢測毛蕊花糖苷對HSC遷移能力的影響

將消毒好的直尺置于6孔板上，用200 μL無菌槍頭沿直尺在培養(yǎng)板底部劃3條平行直線，分別于培養(yǎng)0、24 h后采集圖像，拍照圖像采集點盡量保持前后一致。Image J分析細胞遷移距離，劃痕寬度用l表示，遷移率=(l0h- l24h) /l0h×100%。

1.4 ELISA法檢測Ⅰ型膠原(Col-I)含量

采用ELISA法定量測定不同組別的細胞培養(yǎng)上清液中Col-I含量。用大鼠Col-I抗體包被微孔板，制成固相載體，依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗Col-I抗體、HRP標(biāo)記的親和素，TMB顯色(TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色)。顏色的深淺和樣本中的Col-I呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀下測定吸光度D(450)值，并計算樣本濃度。

1.5 Western blot法 檢 測 α-SMA、 caspase 3、ERK1/2、P-ERK1/2、Akt、P-Akt蛋白表達

HSC細胞培養(yǎng)、分組同上，48 h后收集細胞并分別提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量。取各組細胞總蛋白20 μg進行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳實驗，根據(jù)目的蛋白的大小將包含目的蛋白的凝膠切下，以恒壓100 V、60~90 min進行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉的1×TBST溶液封閉1 h，根據(jù)目的蛋白分別加入一抗，具體的一抗及濃度為：ERK1/2、P-ERK1/2、Akt和P-Akt均為1∶1 000，α-SMA、caspase-3和β-actin均為1∶5 000，4 ℃過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗兔/鼠二抗(Invitrogen)，孵育2 h，β-actin作為內(nèi)參顯色劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 毛蕊花糖苷高效液相圖分析

采用高效液相法測量毛蕊花糖苷的純度，結(jié)果顯示毛蕊花糖苷純度為98.89%，見圖1。

圖1 毛蕊花糖苷高效液相圖分析

2.2 毛蕊花糖苷對HSC遷移能力的影響

細胞劃痕法檢測毛蕊花糖苷對HSC遷移能力影響的結(jié)果顯示，正常對照組細胞遷移率為(38.05±1.95) %，PDGF-BB組細胞為(93.16±3.28)%，可見與對照組比較，PDGF-BB能夠促進HSC的遷移(P<0.01)；毛蕊花糖苷(1.5、3.0、6.0) mg/L組細胞的遷移率分別為(33.11 ±1.20)%、(42.12±1.24)%、(66.55±1.51)%， 與PDGFBB組比較，毛蕊花糖苷1.5、3.0、6.0 mg/L組能明顯抑制HSC的遷移(P<0.01)(圖2)；且毛蕊花糖苷抑制HSC的遷移有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(r=0.894，P=0.038)。

圖2 毛蕊花糖苷對HSC遷移能力的影響

2.3 毛蕊花糖苷對HSC中Col-I含量的影響

肝纖維化時大量ECM在Disse間隙沉積以膠原為主，尤以Col-I為主，這些間質(zhì)成分的改變不但激活HSC，也影響肝細胞的功能，因此我們通過ELISA法對Col-I的含量進行測定，結(jié)果顯示：與正常對照組比較，PDGF-BB組HSC中Col-I含量增加，與PDGF-BB組比較，毛蕊花糖苷(1.5、3.0、6.0 mg/L)組Col-I含量均有一定程度的減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；且隨著毛蕊花糖苷濃度的增加，膠原分泌呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，毛蕊花糖苷各劑量組間呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(r=0.397，P=0.027)，見圖3。提示毛蕊花糖苷能夠抑制HSC的ECM過度沉積及膠原的形成。

2.4 毛蕊花糖苷對HSC活化標(biāo)志物α-SMA蛋白表達的影響

α-SMA作為HSC激活的標(biāo)志，因此我們通過Western blot法對α-SMA蛋白表達進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：rrPDGF-BB作用于HSC細胞后，α-SMA蛋白的表達較對照組明顯增強；與PDGF-BB組比較，毛蕊花糖苷(1.5、3.0、6.0 mg/L)組α-SMA蛋白的表達有所降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；同時，毛蕊花糖苷(1.5、3.0、6.0 mg/L)組α-SMA蛋白表達呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(r=0.975，P<0.01)，見圖4。由此結(jié)果預(yù)測，毛蕊花糖苷可以抑制HSC由靜止表型向表達α-SMA的肌成纖維細胞樣表型轉(zhuǎn)化，抑制HSC在肝損傷部位的移行和增殖。

2.5 毛蕊花糖苷對HSC凋亡效應(yīng)分子caspase-3表達的影響

Caspase-3被視為最重要的凋亡效應(yīng)分子，Western blot法對caspase-3蛋白表達進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，PDGF-BB組呈低表達；毛蕊花糖苷干預(yù)HSC后，與PDGF-BB組比較，caspase-3 蛋白的表達量升高，并且隨著毛蕊花糖苷的濃度增加，其表達量逐漸升高(r=0.982，P<0.001)，呈現(xiàn)藥物劑量-效應(yīng)關(guān)系。見圖5，說明毛蕊花糖苷可以激活caspase-3的活性，促進caspase-3發(fā)揮凋亡執(zhí)行作用。

2.6 毛蕊花糖苷對ERK1/2、Akt信號通路的影響

ERK1/2、Akt激活可促進HSC細胞增殖，PDGF激活的信號通路中ERK1/2、Akt信號通路存在著廣泛的“cross talk”，具有相互協(xié)同或抑制作用。Western blot結(jié)果表明：PDGF-BB作用于HSC 48 h后可以使ERK1/2、P-ERK1/2、Akt、P-Akt蛋白表達明顯增強，而毛蕊花糖苷可以明顯抑制ERK1/2、Akt的活化，PERK1/2、P-Akt蛋白表達水平明顯降低，且不同濃度間呈現(xiàn)藥物劑量-效應(yīng)關(guān)系(0.826

圖4 毛蕊花糖苷對HSC活化標(biāo)志物α-SMA蛋白表達的影響

圖5 毛蕊花糖苷對HSC凋亡效應(yīng)分子caspase-3表達的影響

3 討 論

肝纖維化時HSC是ECM過度沉積的關(guān)鍵細胞，并在肝纖維化的啟動過程中發(fā)揮重要作用，ECM的合成累積循環(huán)變化能活化HSC[5]，其中大量的ECM成分以膠原和PDGF等細胞因子為主[6]；而PDGF又可進一步激活HSC，使其演化為肌成纖維母細胞并表達α-SMA，因此，誘導(dǎo)活化的HSC凋亡并抑制其活化、增殖是防治肝纖維化的有效途徑[7-9]。

圖6 毛蕊花糖苷對ERK1/2、Akt信號通路中ERK1/2、P-ERK1/2、Akt、P-Akt蛋白表達的影響

α-SMA與HSC關(guān)系密切[10-12]，被廣泛用于HSC活化的標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，rrPDGF-BB刺激HSC細胞48 h后，遷移能力顯著增加，α-SMA蛋白的表達明顯增強，同時，酶聯(lián)免疫ELISA定量法檢測HSC中Col-I含量也呈現(xiàn)明顯增加趨勢，表明HSC活化的過程常常伴隨著侵襲能力的增強；而不同濃度的毛蕊花糖苷組干預(yù)后，與PDGF-BB組比較，HSC遷移能力明顯下降，α-SMA蛋白表達明顯降低，Col-I含量顯著減少，證實毛蕊花糖苷可以抑制HSC的侵襲能力、減少PDGF產(chǎn)生、降低HSC活化、降低膠原纖維含量、阻遏肝纖維化的形成。

研究指出，通過藥物防治來促進活化的HSC凋亡或?qū)⒊蔀榫哂星熬暗目垢卫w維化手段[13]。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)的激活是細胞凋亡發(fā)生機制的關(guān)鍵元件，在級聯(lián)反應(yīng)中能夠呈現(xiàn)放大效應(yīng)，caspase抑制劑可逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生。在caspase 家族介導(dǎo)的凋亡信號傳導(dǎo)通路中，caspase-3是執(zhí)行型caspase，處于各條通路的樞紐環(huán)節(jié)，被視為最重要的凋亡效應(yīng)分子，活化后可特異性地裂解底物并切割下游的蛋白激酶、核酸酶以及細胞骨架等，誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，rrPDGF-BB誘導(dǎo)HSC活化后，caspase-3蛋白的表達量顯著降低，毛蕊花糖苷干預(yù)后，其表達量增加，且劑量越高caspase-3蛋白的表達越高，提示毛蕊花糖苷參與了HSC細胞的凋亡，增加caspase-3的活性可促進活化的HSC凋亡。

MAPK信號通路是細胞內(nèi)最重要的促增殖和凋亡通路之一[14]，在HSC的增殖和凋亡中能夠影響其下游細胞周期調(diào)節(jié)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白等效應(yīng)分子的活性[15]，caspase-3被視為最重要的凋亡效應(yīng)分子；caspase-3的活化可調(diào)控ERK1/2、Akt信號通路，這其中，PDGF-BB的作用尤為突出；PDGF-BB與受體PDGFR β偶聯(lián)后誘導(dǎo)酪氨酸殘基的自體磷酸化，引起受體相關(guān)蛋白的募集和激活，進一步激活如ERK、Akt、P38這3個MAPK家族中的主要亞群[16-17]，調(diào)節(jié)細胞的凋亡、免疫反應(yīng)、增殖、基因表達等多重功能。本次實驗結(jié)果證實了PDGF-BB對HSC的增殖、活化及促肝纖維化作用的同時，也發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷能使caspase-3激活，減少ERK1/2、Akt的磷酸化水平，阻斷ERK1/2、Akt信號通路，進而抑制HSC中ECM過度沉積及膠原形成，減少肝纖維化的發(fā)生。

毛蕊花糖苷是一類生物活性很強的化合物，具有消炎、增強免疫、抗缺氧、清除自由基、DNA堿基修復(fù)等多種生理作用，同時，肝纖維化是由一類復(fù)雜的細胞因子和生長因子系統(tǒng)調(diào)節(jié)的慢性、漸進的病理過程，具有可逆性，其病理發(fā)生機制與毛蕊花糖苷的藥理學(xué)防治機制具有很強的相關(guān)性。而對于肝纖維化，至今仍然沒有公認的有效治療方案，因此深入研究毛蕊花糖苷抑制HSC的遷移作用，使ECM分泌減少，促進ECM降解，抑制HSC的增殖并誘導(dǎo)其凋亡可為毛蕊花糖苷的抗肝纖維化作用提供更多的理論依據(jù)。

綜上，本研究表明，毛蕊花糖苷可以抑制PDGFBB誘導(dǎo)的HSC的遷移，降低I型膠原的分泌，抑制α-SMA蛋白的表達降低HSC的活化，并且可以激活HSC最重要的凋亡效應(yīng)分子caspase-3的表達，及通過抑制ERK1/2、P-ERK1/2、Akt、P-Akt蛋白的表達發(fā)揮抗肝纖維化的作用。