陳楸蕗 劉 明 陳德宇*

( 1．阜陽(yáng)師范學(xué)院附屬中學(xué)，安徽 阜陽(yáng) 236041；2．阜陽(yáng)師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236037 )

在睪丸中，生精小管和血液之間存在著血睪屏障(bloodtestis barrier，BTB)，其組成包括間質(zhì)的毛細(xì)血管內(nèi)皮及其基膜、結(jié)締組織、生精上皮基膜和支持細(xì)胞間的緊密連接( tight junction，TJ)，TJ是構(gòu)成BTB的主要結(jié)構(gòu)[1]。支持細(xì)胞緊密連接異常導(dǎo)致生精細(xì)胞在生精小管內(nèi)的移行受阻可能是寡精癥的病因之一[2]。精子發(fā)生是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，在細(xì)胞、生物化學(xué)和分子水平上受到不同分子和不同通路的調(diào)節(jié)。因此，揭示BTB內(nèi)TJ動(dòng)力學(xué)過(guò)程及其在重建過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制，有利于理清精子發(fā)生的機(jī)制。本綜述重點(diǎn)分析血睪屏障中支持細(xì)胞間緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能。

1 支持細(xì)胞

1.1 支持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)

支持細(xì)胞(Sertoli cells)是為發(fā)育中的精子提供保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)的細(xì)胞，精子發(fā)育的各個(gè)階段均發(fā)生在支持細(xì)胞之間。支持細(xì)胞呈錐體形，形狀不規(guī)則，細(xì)胞基部緊貼基底膜，頂部可以到達(dá)生精小管的管腔，細(xì)胞側(cè)面和腔面凹凸交錯(cuò)，相鄰細(xì)胞間鑲嵌著各級(jí)生精細(xì)胞，細(xì)胞側(cè)面近基部的相鄰細(xì)胞膜形成TJ，將生精上皮分成基底室和近腔室?；资椅挥谏掀せず椭С旨?xì)胞TJ之間，內(nèi)有A型和B型精原細(xì)胞；近腔室靠近生精小管管腔，含有精子細(xì)胞和精子[3]。精子發(fā)生時(shí)B型精原干細(xì)胞分化到精母細(xì)胞需要跨越TJ進(jìn)入近腔室，才能進(jìn)一步的發(fā)育成成熟精子(結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1)[4-5]。因此，精子發(fā)生時(shí)生殖細(xì)胞穿越生精上皮的運(yùn)動(dòng)同TJ的結(jié)構(gòu)重建密切相關(guān)。

1.2 支持細(xì)胞的功能

支持細(xì)胞的功能主要包括：提供結(jié)構(gòu)性支持；創(chuàng)建形成血睪屏障；參與生殖細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和排精；通過(guò)分泌產(chǎn)物滋養(yǎng)生殖細(xì)胞等[6]。

圖1 精子發(fā)生時(shí)生精細(xì)胞穿越TJ模式圖[4]

1.2.1 結(jié)構(gòu)性支持 支持細(xì)胞有著豐富的細(xì)胞骨架。這些細(xì)胞骨架在維持支持細(xì)胞形狀、細(xì)胞器定位、細(xì)胞連接的形成、定位錨定輔助生精細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)以及精子的釋放中起著重要作用[7]。它由肌動(dòng)蛋白、中間絲和微管組成。肌動(dòng)蛋白絲由相對(duì)分子質(zhì)量為42 kDa的肌動(dòng)蛋白單體組成，單體聚合成8 nm寬的螺旋線性鏈。有兩種肌動(dòng)蛋白單體，肌動(dòng)蛋白G和肌動(dòng)蛋白F。中間絲聚集于細(xì)胞外基質(zhì)附著部位，參與橋粒連接和半橋粒連接。微管由微管蛋白構(gòu)成，已經(jīng)確定了至少6種微管蛋白，包括α、β、δ、ε、γ和ξ[8-12]。

1.2.2 形成血睪屏障 血睪屏障又稱生精上皮屏障，位于生精上皮基底三分之一的支持細(xì)胞緊密連接處。血睪屏障將生精上皮劃分成兩個(gè)隔室，一個(gè)是基底室，內(nèi)有精原細(xì)胞、細(xì)線前期細(xì)胞和細(xì)線期細(xì)胞。另一近腔室內(nèi)含有精子細(xì)胞[13]。

血睪屏障有3個(gè)主要功能：創(chuàng)造一個(gè)專門的微環(huán)境；調(diào)節(jié)分子的通過(guò)；用作免疫屏障[14]。首先，血睪屏障創(chuàng)造的微環(huán)境有利于生殖細(xì)胞發(fā)育和運(yùn)動(dòng)。比如，生殖細(xì)胞位于管腔內(nèi)無(wú)法獲得血清鐵，但支持細(xì)胞可以將其合成的轉(zhuǎn)鐵蛋白分泌至微環(huán)境內(nèi)，供生精細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和廢物進(jìn)出生精上皮主要靠血睪屏障的調(diào)節(jié)。血睪屏障創(chuàng)建了一個(gè)免疫屏障，確保免疫系統(tǒng)不能識(shí)別存在于生殖細(xì)胞表面的特異性抗原。最近的研究表明，支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生干擾素(interferon，IFN)、白介素(interleukins，ILs)和細(xì)胞因子來(lái)維持獨(dú)特的防御系統(tǒng)。血睪屏障也阻止免疫球蛋白和淋巴細(xì)胞進(jìn)入近腔室[15-17]。

與血腦屏障相比較，血睪屏障的不同之處在于它必須定期開(kāi)啟，以保證精子發(fā)生過(guò)程中生殖細(xì)胞的通過(guò)。例如，發(fā)育中的細(xì)線前期/細(xì)線期的精母細(xì)胞必須穿過(guò)血睪屏障。這個(gè)過(guò)程牽涉到緊密連接的解離和重組。但生殖細(xì)胞在血睪屏障內(nèi)的運(yùn)動(dòng)機(jī)制未被充分解析。另外調(diào)節(jié)血睪屏障形成和維持其穩(wěn)定的因素目前還不清楚。其主要原因是關(guān)于血睪屏障生物學(xué)信息的缺乏，以及缺乏適合用來(lái)研究支持細(xì)胞緊密連接動(dòng)力學(xué)的體外和體內(nèi)模型[18]。

1.2.3 協(xié)助生殖細(xì)胞移位 支持細(xì)胞直接參與生精細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，因?yàn)樯?xì)胞缺乏遷移細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征。生殖細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的潛在機(jī)制可能涉及三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)酶超家族的成員。有研究表明伸長(zhǎng)/延長(zhǎng)的精子細(xì)胞跨生精上皮的易位主要是由胞外基質(zhì)賦予的。微管連同幾種運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白，如動(dòng)力蛋白、肌球蛋白VIIa、腺嘌呤核苷三磷酸酶和GTP酶協(xié)助精子細(xì)胞在生精上皮內(nèi)遷移。不過(guò)仍有許多問(wèn)題需進(jìn)一步解答。比如，如果生殖細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)必須與它們的發(fā)育狀態(tài)相一致，那么什么信號(hào)決定了上皮周期中精細(xì)胞在上皮細(xì)胞中的適時(shí)運(yùn)動(dòng)？什么是調(diào)節(jié)外質(zhì)特化重組的機(jī)制？當(dāng)細(xì)胞需要向前移動(dòng)時(shí)，如何向支持細(xì)胞發(fā)出信號(hào)？要回答這些問(wèn)題，必須完全闡明胞外基質(zhì)的生物化學(xué)結(jié)構(gòu)。另外支持細(xì)胞也協(xié)助早期減數(shù)分裂的精母細(xì)胞從基底到腔室的移位。這一過(guò)程可能需要支持細(xì)胞間和支持-生殖細(xì)胞連接的分解與重新組裝，是一個(gè)高度選擇性的過(guò)程。比如A型精原干細(xì)胞必須保留在基底膜上，不能移動(dòng)。這就需要一個(gè)高效的選擇機(jī)制來(lái)確定哪些特定類型的細(xì)胞可以穿越生精上皮[19]。

1.2.4 排精 這個(gè)過(guò)程涉及一系列細(xì)胞生物學(xué)事件，包括：支持細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)包裹精細(xì)胞；從支持細(xì)胞近腔端驅(qū)離精子細(xì)胞；精細(xì)胞的釋放。

1.2.5 吞噬 精子細(xì)胞變態(tài)成精子過(guò)程中釋放出來(lái)的殘余成分，以及在精子發(fā)生過(guò)程中退化的生殖細(xì)胞都由支持細(xì)胞負(fù)責(zé)吞噬清理[20]。

1.2.6 提供營(yíng)養(yǎng) 支持細(xì)胞合成的氨基酸、碳水化合物、脂質(zhì)、維生素和金屬離子需要足量地遞送到血睪屏障后面的精子細(xì)胞和精子中。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從支持細(xì)胞轉(zhuǎn)移到生殖細(xì)胞理論上是可能的。單獨(dú)培養(yǎng)生殖細(xì)胞時(shí)，最多存活24 h，如果與支持細(xì)胞共培養(yǎng)，生殖細(xì)胞可以在體外存活達(dá)8 d左右。這一現(xiàn)象提示支持細(xì)胞可以給生精細(xì)胞提供養(yǎng)分[21]。

2 緊密連接

在睪丸中，緊密連接是由原纖維組成的相鄰細(xì)胞的質(zhì)膜(通常為50~100個(gè))完全包圍每個(gè)細(xì)胞的基底區(qū)域之間緊密接觸的區(qū)域。其主要成分是occludin和claudin蛋白[22]。與在其他上皮細(xì)胞形成的緊密連接不同，睪丸中緊密連接的連接位置獨(dú)特，因?yàn)樗鼈冏罱咏啄?，基底膜是?xì)胞外基質(zhì)的修飾形式。

2.1 緊密連接的功能

緊密連接有兩個(gè)主要功能：形成屏障以及形成相對(duì)封閉的空間。首先，緊密連接會(huì)產(chǎn)生一個(gè)半滲透的屏障，限制分子的通過(guò)。分子的通過(guò)在很大程度上取決于它們的相對(duì)分子質(zhì)量和化學(xué)性質(zhì)。實(shí)際上，為適應(yīng)不同器官的生理需求，緊密連接的滲透性在不同組織中不一樣，且可以調(diào)節(jié)。蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑原釩酸鈉能夠干擾MDCK細(xì)胞緊密連接的通透性，表明蛋白酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶抑制劑可能干擾支持細(xì)胞緊密連接屏障的裝配。其次，睪丸中緊密連接形成的邊界將支持細(xì)胞分成基底和近腔兩部分，這被稱為緊密連接的圍欄功能。該功能賦予上皮細(xì)胞的極性。緊密連接的柵欄功能阻止了兩個(gè)區(qū)域之間的分子如蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的混合[23]。

2.2 緊密連接相關(guān)的蛋白

2.2.1 ZO-1 ZO-1是一種210~225 kDa的外周膜蛋白，與上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的緊密連接相關(guān)。ZO-1與occludin的C末端相連，ZO-1與occludin的化學(xué)計(jì)量比為1∶1。ZO-1還與上皮細(xì)胞和非上皮細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白和α-連環(huán)蛋白相關(guān)聯(lián)，當(dāng)上皮細(xì)胞的緊密連接受到損害時(shí)，ZO-1從緊密連接部位解離并返回胞內(nèi)。這個(gè)過(guò)程是由肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架介導(dǎo)的。在睪丸中，ZO-1幾乎完全定位于血睪屏障的支持細(xì)胞緊密連接處。研究表明[24]， ZO-1有兩種不同的異構(gòu)體a-和 a+，它們分別是mRNA選擇性剪接的不同產(chǎn)物。ZO-1a-和ZO-1a+分別在成年期和青春期表達(dá)，表明這些同種型對(duì)于緊密連接解體和組裝至關(guān)重要。除occludin外，ZO-1還可與其他蛋白如F-actin、JAM、claudin-1、cingulin、spectrin、PAR-3和Rab8等相結(jié)合[25]。

2.2.2 ZO-2 ZO-2的相對(duì)分子質(zhì)量為160 kDa，定位于睪丸內(nèi)。ZO-2的3個(gè)MAGUK結(jié)構(gòu)域與ZO-1有51%的同源性，但C端僅有25%的同源性。ZO-2可以被PKC-t，-c，-h磷酸化，說(shuō)明它可以被蛋白激酶激活。其他體外和體內(nèi)研究已經(jīng)證明ZO-2能夠結(jié)合occludin和claudin蛋白[26]。一些報(bào)道還證實(shí)了ZO-2能夠與F-肌動(dòng)蛋白和α-連環(huán)蛋白的關(guān)聯(lián)，提示該分子也可能參與黏附連接的調(diào)節(jié)[27]。

2.2.3 ZO-3 ZO-3首先被鑒定為MDCK細(xì)胞中的130 kDa多肽并命名為p130，隨后的研究發(fā)現(xiàn)它與ZO-1及ZO-2有高度同源性，因此被重新命名為ZO-3。在MDCK細(xì)胞中，ZO-3與ZO-1和ZO-2一樣，在絲氨酸和酪氨酸殘基上都可以磷酸化。免疫熒光顯微結(jié)果和免疫電鏡顯微結(jié)果均顯示ZO-3與ZO-1共定位于緊密連接處。其他研究發(fā)現(xiàn)它與occludin、claudin、actin和Pals1相關(guān)的緊密連接蛋白相互作用，但與ZO-2不相關(guān)[28]。

2.2.4 occludin蛋白 occludin是裝配緊密連接的重要蛋白質(zhì)[29]。人的occludin基因定位于5q13.1，其相對(duì)分子質(zhì)量為64 kDa，由504個(gè)氨基酸組成，共有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其羧基端和氨基端都位于胞膜內(nèi)的胞質(zhì)區(qū)，細(xì)胞膜外有2個(gè)細(xì)胞外環(huán)，它們富含絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基，分別叫Occ-1和Occ-2。Occ-1有由大約60%的酪氨酸和甘氨酸殘基組成，能夠形成疏水結(jié)構(gòu)，相鄰Sertoli’s細(xì)胞間的Occ-1外環(huán)交錯(cuò)形成封閉區(qū)域，參與細(xì)胞間黏附；Occ-2對(duì)緊密連接有特異性的調(diào)控功能，是組裝進(jìn)緊密連接的必需結(jié)構(gòu)域，參與旁細(xì)胞屏障的形成(其分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2)。相鄰支持細(xì)胞occludin的胞外環(huán)通過(guò)“親吻式接觸”，以拉鏈結(jié)構(gòu)開(kāi)啟或關(guān)閉細(xì)胞的緊密連接[30](其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3)。occludin蛋白與多種疾病相關(guān)：在腸上皮中，occludin 組裝的TJ起著保護(hù)腸黏膜的作用，occludin表達(dá)異常會(huì)出現(xiàn)腸炎腹瀉等癥狀[31]；作為血腦屏障的組分，occludin表達(dá)異常會(huì)引起血-腦屏障的功能紊亂[32]；作為上皮保護(hù)屏障，occludin與病毒感染相關(guān)[33-34]；腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移與細(xì)胞間連接力的喪失有關(guān)，occludin下調(diào)或缺失會(huì)加速腫瘤細(xì)胞發(fā)生和轉(zhuǎn)移[35]；作為TJ的組分，occludin是生精上皮中支持細(xì)胞間形成TJ結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，其程序性的開(kāi)啟與關(guān)閉保證了精子發(fā)生正常進(jìn)行，若異常開(kāi)放則會(huì)影響精子發(fā)生的正常進(jìn)程。干擾睪丸支持細(xì)胞內(nèi)occludin蛋白的功能狀態(tài)，會(huì)導(dǎo)致不育[36-37]。BTB的TJ不同于血腦屏障及其他屏障的TJ，它關(guān)系到精原細(xì)胞在支持細(xì)胞間的運(yùn)行及分化，牽涉到支持細(xì)胞間TJ的瓦解和重建，但其調(diào)控機(jī)制未見(jiàn)深入報(bào)道。因此研究和探討TJ瓦解和重建的分子機(jī)制，特別是分析occludin在此過(guò)程中的動(dòng)態(tài)進(jìn)程，對(duì)進(jìn)一步了解精子發(fā)生的分子機(jī)制及寡精癥病因的解析具有重要意義。

2.2.5 claudin蛋白 claudin超家族至少有24種蛋白，是緊密連接的主要構(gòu)件之一，它完全定位于緊密連接部位。claudin的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與occludin相似，除了claudin的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和第二個(gè)細(xì)胞外環(huán)明顯更小以外，不同的claudin蛋白與occludin并無(wú)任何顯著的序列同源性。每種claudin的表達(dá)模式在不同的組織中差異很大。claudin 11主要表達(dá)于睪丸和大腦，在腎臟中也幾乎檢測(cè)不到。claudins是否磷酸化尚不清楚，但claudins的C末端含有蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、酪蛋白激酶2和cAMP依賴性蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)。事實(shí)上，各種claudins之間的最大差異在于它們的C端，這表明claudins的C末端是參與不同器官中緊密連接的關(guān)鍵位點(diǎn)。C末端的最后兩個(gè)氨基酸殘基Tyr-Val存在于大多數(shù)claudins中，是它們與PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用所必需的氨基酸。研究表明細(xì)胞在任何時(shí)候都可以表達(dá)兩種以上的claudin蛋白，而且兩種細(xì)胞之間不同claudin蛋白的組合決定了緊密連接的通透性和物理尺寸[38]。這決定了不同細(xì)胞和組織緊密連接的獨(dú)特性質(zhì)。睪丸內(nèi)有7種不同的claudins，即claudins 1、3~5、7~8和11。claudin 11是睪丸中唯一被詳細(xì)研究的緊密連接蛋白，僅定位于支持細(xì)胞的血睪屏障部位。在小鼠睪丸中，claudin 11表達(dá)模式與出生后第6~16天的血睪屏障的組裝一致，并且在FSH和TNF-α的作用下其在支持細(xì)胞中的表達(dá)可被抑制。更重要的是，基因敲除實(shí)驗(yàn)證明缺乏claudins 11的小鼠是不育的[39]，表明血睪屏障的完整性對(duì)于正常精子發(fā)生至關(guān)重要。

圖2 occludin分子結(jié)構(gòu)模式圖[29]

圖3 相鄰支持細(xì)胞occludin形成TJ模式圖[29]

2.2.6 JAMs JAM是新近研究的免疫球蛋白超家族成員，主要定位于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接部位。不過(guò)尚無(wú)確切實(shí)驗(yàn)證明JAM是否是緊密連接的實(shí)際組成部分。到目前為止，已經(jīng)確定了3個(gè)JAM成員，即JAM 1~3，Northern印跡證明了JAM1和2在睪丸中的表達(dá)[40]。JAM與occludin、ZO-1和cingulin共定位。其他報(bào)道[41]表明，JAM與AF-6、ASIP / PAR-3、MUPP1蛋白和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸蛋白激酶相關(guān)。使用抗JAM抗體后，白細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移被抑制；TNF-α和IFN-γ的摻入會(huì)導(dǎo)致JAM在細(xì)胞內(nèi)的再分布，可以增強(qiáng)白細(xì)胞在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上的遷移[42]。這些結(jié)果提示JAM與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)。但JAM如何調(diào)控生精細(xì)胞的遷移，有待進(jìn)一步研究。

2.2.7 柯薩奇病毒和腺病毒受體(CAR)CAR是一種46 kDa的跨膜蛋白，具有跨膜、胞質(zhì)區(qū)、胞外區(qū)域和兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。雖然現(xiàn)在推測(cè)CAR在緊密連接動(dòng)力學(xué)中的功能還為時(shí)過(guò)早，但CAR能夠介導(dǎo)病毒附著和感染。例如，柯薩奇病毒和腺病毒是兩種腸道病毒，其在感染過(guò)程中穿過(guò)上皮(胃腸道或呼吸道)中的緊密連接處，導(dǎo)致緊密連接完整性的喪失，然后運(yùn)行到心臟和大腦。其運(yùn)行機(jī)制可能與JAM(最近被確定為哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒的受體)和claudin(也可以作為產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素的受體)類似。在非極化細(xì)胞中，CAR定位于細(xì)胞間接觸處，說(shuō)明CAR可促進(jìn)細(xì)胞黏附。在極化的上皮細(xì)胞中，CAR和ZO-1共定位在緊密連接部位。CAR的過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)屏障功能。最近研究發(fā)現(xiàn)CAR在小鼠的生殖細(xì)胞中有表達(dá)，但其在支持細(xì)胞中的功能仍有待確定[43]。

2.2.8 其他蛋白 在緊密連接部位陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)其他緊密連接相關(guān)蛋白：Cingulin、symplekin、血影蛋白/胞影蛋白、7H6、AF-6、PAR-6、非典型PKC、Sec 6、Sec 8、Rab13、ab3B、ZONAB、ASH1、19B1、ASIP、MAGI蛋白和WNK1激酶。

3 展 望

關(guān)于連接動(dòng)力學(xué)的研究已經(jīng)成熟，研究人員對(duì)確定連接處復(fù)合物是如何被組合成能緊密和黏附連接點(diǎn)感興趣。有關(guān)緊密結(jié)合和生殖細(xì)胞運(yùn)動(dòng)之間的相互關(guān)系有幾個(gè)問(wèn)題仍不清楚。例如，一個(gè)典型的上皮細(xì)胞如何感知極性/方向，使得緊密和黏連連接可以被正確組裝？細(xì)胞連接裝配/拆卸與內(nèi)吞之間是否有聯(lián)系？底層肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架涉及到什么程度？大多數(shù)情況下，細(xì)胞連接以這樣的方式組裝，即它們可以固有區(qū)分上皮細(xì)胞的頂端區(qū)域和基底外側(cè)區(qū)域。體外的緊密連接也需要在膜表面積上急劇增加，最終形成一個(gè)高的柱狀上皮。此外，在緊密連接組裝之前，功能性黏連連接必須首先被組裝，相關(guān)蛋白如何順序性執(zhí)行功能仍有待深入探討。這些問(wèn)題的解答對(duì)于精子發(fā)生的闡釋具有重要意義。