彭 洪，林中超

(四川省南充市中心醫(yī)院中西醫(yī)結合肛腸科，四川 南充 637000)

結直腸癌在全世界范圍內(nèi)是排名第三的惡性腫瘤。每年有接近130萬新診斷病例，并且每年有70萬人因為結直腸癌而死亡。雖然近年來西方國家結直腸癌的發(fā)病率和死亡率有所下降，但是在中國和其他一些發(fā)展中國家，發(fā)病率和死亡率卻有所上升。因此，闡明其具體作用機制對于結直腸癌的早期診斷和治療至關重要。TACC2(transforming acidic coiled-coil proteins 2)是TACC蛋白家族成員之一，其主要位于中心體，可調(diào)控微管蛋白的形成和調(diào)控細胞有絲分裂，因此對于染色體的穩(wěn)定具有重要作用[1]。如果TACC2蛋白表達出現(xiàn)變化，可能導致基因穩(wěn)定性降低甚至形成腫瘤[2]。也有研究發(fā)現(xiàn)TACC2可與核組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶共同作用參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[3]。有研究報道TACC2基因的高表達與乳腺癌和前列腺癌的發(fā)病密切相關[4，5]。然而TACC2基因在結直腸癌中的表達及與結直腸癌發(fā)生發(fā)展的關系及作用機制尚未見報道。小干擾RNA(siRNA)可通過沉默目標基因來發(fā)揮作用，因此本研究采用RNA干擾技術抑制結直腸癌中TACC2基因的表達，探討TACC2在結直腸癌增殖中的作用和其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1材料人結直腸癌細胞系LoVo、HCT116及SW480細胞，均購自重慶醫(yī)科大學基礎研究所。2016年2月至2017年10月，收集在南充市中心醫(yī)院行根治性手術的20例結直腸癌患者的癌組織標本及匹配的癌旁正常組織，所有組織標本均經(jīng)病理切片證實為原發(fā)性結直腸癌。所有結直腸癌手術患者術前未接受其他抗腫瘤治療。

1.2方法

1.2.1TACC2在結直腸癌和癌旁組織中的表達 將收集的腫瘤組織和癌旁組織標本粉粹后放于EP管中，加入細胞裂解液，混勻并冰置15 min，然后離心20 min(4 ℃，10000 g)，收集的上清液為細胞總蛋白。蛋白免疫印跡法(Western Blot)用于檢測TACC2蛋白的表達，其具體操作方法參照前期文獻。Quantity One 軟件用于分析TACC2蛋白表達水平。

1.2.2高表達TACC2蛋白的結直腸癌細胞系的篩選 蛋白免疫印跡法用于檢測人結直腸癌細胞系LoVo、HCT116及SW480細胞中TACC2蛋白的表達。

1.2.3TACC2 siRNA的設計和轉(zhuǎn)染 根據(jù)TACC2基因序列和小干擾RNA設計原則，設計TACC2 siRNA序列如下：sense 5’-GCU AAA GGU ACU UAC ACC UUG AUA-3’，antisense 5’-UAU CAA AGG UGU AAG UAC CUU UAG C-3’。同時設計合成與TACC2基因無同源性的陰性對照組siRNA-NC： sense 5’-CAA UAC GUA CUA UCG CGC GGA UTT-3’，antisense 5’-AUC AAA CGC GCG ATA GUA CGU ATT-3’，并設置空白對照組Blank，委托廣州萊博生物科技有限公司合成。利用腺病毒將TACC2 siRNA，siRNA-NC轉(zhuǎn)染入LoVo細胞。

1.2.4熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測TACC2基因的表達 用PCR法檢測TACC2 siRNA，siRNA-NC和Blank組細胞中TACC2基因的表達，具體操作步驟參考前期文獻。TACC2的上游引物：5’-AGC CAG CGA CCT GAA CCT-3’，下游引物： 5’-GAG GTC AGC ACA CAG CCA C-3’。GAPDH的上游引物：5’-CAT GCA GGC TAC CAT CCA TGT-3’，下游引物： 5’-GTT AGC AGT GAT GCC TAC CAA-3’。結果提示TACC2 siRNA沉默基因的效果最強。采用相對定量比較CT值法分析數(shù)據(jù)。

1.2.5MTT檢測細胞增殖能力 將轉(zhuǎn)染TACC2 siRNA，siRNA-NC和Blank組的結直腸癌 LoVo細胞系以每孔2×104個接種于96孔板，每組4個復孔，培養(yǎng)24小時及48小時后每孔加MTT 20ul，4 h后棄上清液。然后每孔加二甲基亞砜(DMSO)150ul，震蕩10分鐘后于490 nm處測定吸光度(A)值。實驗重復進行3次。

1.2.6TACC2下游基因的篩選 為進一步研究TACC2基因調(diào)控細胞增殖的具體作用機制，我們從Pubmed Gene上搜索可與TACC2相互作用的下游基因，發(fā)現(xiàn)p300可與TACC2相互作用。

1.2.7TACC2對p300基因表達的影響 將轉(zhuǎn)染TACC2 siRNA和Blank組的結直腸癌 LoVo細胞以每孔2×105個接種于6孔板過夜。48小時后收集各組細胞，進行免疫印跡分析。p300蛋白的表達用Quantity One圖像分析軟件進行吸光度分析。

1.2.8TACC2對結直腸癌 LoVo細胞p300組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)活性的影響 將轉(zhuǎn)染TACC2 siRNA和Blank組的結直腸癌 LoVo細胞以每孔2×105個接種于6孔板過夜。48小時后收集各組細胞，應用活性光度法檢測p300-HAT活性，觀察TACC2對結直腸癌 LoVo細胞p300-HAT活性的影響。

1.2.9TACC2對缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)表達的影響 將轉(zhuǎn)染TACC2 siRNA和Blank組的結直腸癌 LoVo細胞以每孔2×105個接種于6孔板過夜。48小時后收集各組細胞，進行免疫印跡分析。HIF-1α蛋白的表達用Quantity One圖像分析軟件進行吸光度分析。

1.3統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進行分析。定性變量用計數(shù)(%)表示，定量變量用均數(shù)±標準差表示。計量資料符合正態(tài)分布的采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的采用Mann-Whitney秩和檢驗。三組以上的數(shù)據(jù)采用單向方差分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1TACC2蛋白在不同組織中表達水平比較TACC2蛋白在結直腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(t=53.67，P< 0.05)。見圖1。

圖1 TACC2蛋白表達 a：癌旁正常組織；b：結直腸癌組織

2.2TACC2蛋白在不同結直腸癌細胞系中的表達

TACC2蛋白在LoVo細胞中的表達水平高于HCT116及SW480，差異有統(tǒng)計學意義(F=1022，P< 0.05)。見圖2。因此我們選擇LoVo細胞系用于后續(xù)研究。

圖2 TACC2蛋白在不同細胞系中表達 A.LoVo細胞；B.HCT116細胞；C.SW480細胞

2.3PCR檢測靶向抑制TACC2基因后的沉默效果TACC2 siRNA，siRNA-NC和blank轉(zhuǎn)染到入LoVo細胞后TACC2基因△CT值分別為(4.09±0.02)、(2.39±0.03)、(2.41±0.03)，差異有統(tǒng)計學意義(F=11701，P< 0.05)。見圖3。

圖3 TACC2基因沉默效果 a. siRNA-NC；b. Blank；c. siRNA

2.4沉默TACC2基因?qū)毎鲋车挠绊憣ACC2 siRNA、siRNA-NC和blank轉(zhuǎn)染入LoVo細胞后，在24小時和48小時檢測細胞增殖能力。見表1。

表1 LoVo細胞增殖能力

2.5沉默TACC2基因?qū)300蛋白表達的影響siRNA組與blank組對p300蛋白表達的影響差異無統(tǒng)計學意義(t=0.342，P> 0.05)。見圖4。

圖4 p300蛋白的表達 a. siRNA；b. blank

2.6沉默TACC2基因?qū)300-HAT活性的影響siRNA組p300-HAT活性為(0.00071±0.00004)，明顯低于blank組(0.00167±0.00005)，差異有統(tǒng)計學意義(t=49.19，P< 0.05)。

2.7沉默TACC2基因?qū)IF-1α表達的影響與blank組相比，siRNA組HIF-1α蛋白表達量明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(t=62.57，P< 0.05)。見圖5。

圖5 HIF-1α的表達 a： siRNA；b：blank

3 討論

RNA干擾一般是通過siRNA來實現(xiàn)的，其可特異性的降解同源mRNA，并可抑制目的基因的表達[6]。本實驗結果顯示基于TACC2基因的siRNA能夠有效抑制結直腸癌LoVo細胞中TACC2基因的表達，為下一步實驗的開展奠定了基礎。

TACC蛋白家族成員包括TACC1，TACC2和TACC3，這3個TACC蛋白基因組區(qū)域在某些腫瘤中存在重排，因此在不同的腫瘤組織中它們的表達水平可能不同[7～10]。如TACC3在肺癌細胞株中高表達，但是其在卵巢癌和甲狀腺癌中的表達卻明顯降低[11，12]。在細胞有絲分裂期中TACC1在中心體上定位較弱，TACC2在中心體上定位較強，而TACC3在中心體及其附近都有較強的定位[13，14]。TACC1，TACC2和 TACC3定位的不同提示它們的功能可能存在差異。既往研究發(fā)現(xiàn)TACC2在乳腺癌和前列腺癌中明顯高表達，并且TACC2表達水平與臨床病理特征和患者預后密切相關。進一步研究發(fā)現(xiàn)外源性TACC2可明顯促進乳腺癌細胞的增生，然而用siRNA沉默TACC2基因后則可明顯抑制前列腺癌細胞增殖[4，5]。到目前為止TACC2基因與結直腸癌發(fā)生發(fā)展的關系并無相關報道。本研究結果發(fā)現(xiàn)TACC2基因在結直腸癌中的表達明顯高于癌旁正常組織，說明TACC2參與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展。進一步我們發(fā)現(xiàn)TACC2蛋白在LoVo細胞中的表達水平高于HCT116和SW480細胞中的表達，當用RNA干擾抑制TACC2基因的表達后LoVo細胞增殖能力明顯下降，提示TACC2基因可能作為一種癌基因促進結直腸癌的發(fā)生。

為進一步研究TACC2基因調(diào)控結直腸癌細胞增殖的具體作用機制，我們從Pubmed Gene上搜索可與TACC2相互作用的基因，發(fā)現(xiàn)p300可與TACC2相互作用。人p300基因又稱為p300蛋白，是一個重要的轉(zhuǎn)錄輔助活化因子，可為轉(zhuǎn)錄活化各組分如蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)和DNA之間的相互作用提供支架，并且p300可通過其具有的乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)活性調(diào)節(jié)核小體組蛋白，使染色質(zhì)結構變得疏松從而促進轉(zhuǎn)錄，同時p300也可以直接乙?；恍┺D(zhuǎn)錄因子調(diào)控其活性，參與DNA修復、細胞增殖、分化及細胞凋亡等生物學過程[15，16]。p300作為p53、FOXO3 a和BRCA1的轉(zhuǎn)錄輔助活化因子，可發(fā)揮抑癌作用。然而在特定條件下p300作為c-Myc和AR的轉(zhuǎn)錄輔助活化因子也可促進腫瘤的發(fā)生，如p300可通過激活AR依賴性轉(zhuǎn)錄促進前列腺癌生長，當使用siRNA下調(diào)p300表達也可以抑制其增殖[17]。并且p300在腫瘤的化療敏感性方面也有重要作用，其可介導阿霉素在膀胱癌中的化療耐藥[18]。本研究分析了TACC2和p300之間的相互作用，結果發(fā)現(xiàn)沉默TACC2后p300蛋白的表達并無明顯變化，但是p300-HAT活性則明顯降低，說明TACC2可能通過調(diào)控p300-HAT活性來發(fā)揮作用。

HIF-1α屬于bHLH-PAS蛋白家族，是缺氧反應的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，其主要功能是調(diào)節(jié)機體適應缺氧環(huán)境。缺氧是惡性腫瘤包括結直腸癌的重要微環(huán)境特點，既往研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在結直腸癌、肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中高表達[19]，并且作為轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α可激活下游多種靶基因促進腫瘤血管的生成，腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移[20]。現(xiàn)有研究證實HIF-1α的C端反式激活域(C-terminal tmansactivation domain，CATD)可以與p300的CH1結構域結合，而CH1作為CATD結構域折疊的支架，可通過疏水極性相互作用使p300/HIF-1α復合物保持穩(wěn)定[21]。p300/HIF-1α復合物可作為蛋白支架把不同轉(zhuǎn)錄因子連接到轉(zhuǎn)錄元件，同時p300具有的乙酰轉(zhuǎn)移酶可通過調(diào)節(jié)組蛋白而改變?nèi)旧|(zhì)活性及結構，從而影響下游靶基因如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達來調(diào)控腫瘤細胞的增殖，因此以p300/HIF-1α復合物作為靶點的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑在抗腫瘤方面有很好的應用前景[22]。我們的研究發(fā)現(xiàn)沉默TACC2基因后HIF-1α的表達明顯降低，目前尚無TACC2和HIF-1α直接作用的相關報道，我們分析其作用機制可能是因為沉默TACC2后p300-HAT活性降低，導致具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的p300/HIF-1α復合物表達下降，并進一步引起下游靶基因的表達抑制從而調(diào)控腫瘤細胞的增殖。

本實驗通過RNA干擾抑制TACC2基因的表達后研究其對LoVo細胞增殖的影響極其作用機制，發(fā)現(xiàn)TACC2基因沉默后可抑制結直腸癌LoVo細胞增殖，其作用機制可能與下調(diào)TACC2/p300/HIF-1α信號通路有關。本實驗證實了靶向TACC2/p300/HIF-1α信號通路的表達可為結直腸癌提供新的治療策略，當然關于TACC2基因與p300的作用靶點，與下游基因的具體調(diào)控關系，及在動物實驗中的效果還需要更加深入的研究。