楊馭媒，馬 誓，毛元英，張 可，李新麗

(1.成都市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610051；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610072)

高膽固醇血癥在發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家都是非常嚴(yán)重的健康問題，也是動(dòng)脈粥樣硬化和心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素[1，2]。隨著生活水平的提高，我國國民生活習(xí)慣也發(fā)生改變，心腦血管疾病的發(fā)病率也越來越高，而血總膽固醇(Total cholesterol，TC)水平升高被認(rèn)為是冠心病死亡率增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。高膽固醇血癥的發(fā)生是由環(huán)境因素(包括吸煙、運(yùn)動(dòng)、飲食等)和遺傳因素共同作用[4]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，ABCA1基因上多態(tài)位點(diǎn)與血脂水平相關(guān)[5～7]。SNTB1基因編碼蛋白β1-syntrophin(β1互養(yǎng)蛋白)與ABCA1相互結(jié)合所形成的復(fù)合體對(duì)膽固醇代謝具有調(diào)控作用[8]。因此，本文選取SNTB1基因上3個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)，通過病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)研究分析其與四川地區(qū)中國漢族人群高膽固醇血癥的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象2013年5月至2018年1月，成都市第六人民醫(yī)院和四川省人民醫(yī)院的門診和住院患者以及健康體檢人群，年齡40～75歲，有嚴(yán)重疾病可能影響長期生存的參加者被排除。高膽固醇血癥定義根據(jù)2007年中華心血管病學(xué)會(huì)制定的《血脂異常防治建議》標(biāo)準(zhǔn)：血漿總膽固醇水平≥5.2 mmol/L[9]，問卷調(diào)查包括吸煙、家族史等。醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)本項(xiàng)研究，研究對(duì)象均簽署知情同意書。均為四川地區(qū)漢族人群。

1.2生化檢測血漿葡萄糖(GLU)、甘油三脂(TG)、TC、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)的測定：所有受試者空腹(8小時(shí)以上)采集靜脈血；所有檢測均在成都市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行。

1.3基因組DNA提取將收集的5 ml人外周血離心去除血清；接著加入0.2%NaCl溶液，輕輕振蕩5～6次，放置于冰上15分鐘，2500 rpm離心30分鐘，收集沉淀物；用0.2%的NaCl溶液洗滌一次；加入10 mMTris-HCl(pH8.0)和10 mM EDTA(4 m1)，10%SDS，25 mg/ml的蛋白酶K和10 mg/ml的RNaseA，其加入量分別為4 ml、16 μl和20 μl，上下顛倒混勻，37 ℃過夜溫育；過夜后，加入4 ml酚/Tris溶液，上下顛倒混勻，3000 rpm離心10分鐘，用氯仿提取兩次，以獲得水相，往其中加l/10，3 M NaAC (pH 5.2)，兩倍體積的無水乙醇，使DNA沉淀；用70%的乙醇洗滌以獲得基因組DNA；溶解于TE中，然后定量測定在260 nm的吸收率。DNA工作液濃度校正至50 ng/μl，置-20 ℃冰箱保存。

1.4PCR擴(kuò)增針對(duì)SNTB1基因上3個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)(rs7839488、rs4395927和rs4455882)，通過NCBI數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)獲得基因組序列，采用Primer 3.0在線軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程有限公司合成(PCR引物序列見表2)。反應(yīng)體系10 μl，其中DNA模板1.0 μl，上下游引物0.3 nmol/L，dNTP 0.3 mmol/L，Taq酶0.2 μl，MgCl21.5 mmol/L，ddH2O補(bǔ)充至10 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5分鐘，35個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30秒，57 ℃退火30秒，72 ℃延伸30秒)，然后72 ℃延伸7分鐘。

1.5基因分型采用單堿基延伸法(SNaPSHOT)。首先進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化：PCR產(chǎn)物3 μl，加入SAP 2 μl，ExoI酶0.1 μl，SAP 10×Buffer 0.1 μl，ddH2O補(bǔ)充至10 μl；純化反應(yīng)程序?yàn)椋?7 ℃ 1小時(shí)，75 ℃ 15分鐘。第二步進(jìn)行SNaPSHOT反應(yīng)：SNaPSHOT MULTIPLEX 1μl，純化好的PCR產(chǎn)物1 μl，SNAPSHOT引物(引物序列見表1)0.2 μl，ddH2O補(bǔ)足5 μl；反應(yīng)程序：96 ℃ 1分鐘，25個(gè)循環(huán)(96 ℃ 10秒，50 ℃ 5秒，60 ℃ 30秒)。第三步為第二次純化：上一步反應(yīng)產(chǎn)物中加入SAP 1.0 μl，程序：37 ℃ 1小時(shí)，75 ℃ 15分鐘。最后取上述產(chǎn)物1 μl加入9μl HD，混勻后上ABI 3730XL測序儀檢測基因型，Genemap軟件讀取基因分型情況。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)分析使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間分析采用t檢驗(yàn)。Hardy-Weinberg 平衡、等位基因頻率的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用多因素回歸分析SNP位點(diǎn)與高膽固醇血癥的相關(guān)性，校正年齡、性別、吸煙史，單倍型分析采用Haploview 4.2軟件。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 SNTB1基因SNP位點(diǎn)引物序列情況

2 結(jié)果

2.1兩組基本情況比較如表2所示，本研究中高膽固醇血癥(HTC)組766例(男391例)，正常對(duì)照(NC)組913例(男456例)。HTC組體重、血壓、血糖、總膽固醇及血脂水平均顯著高于NC組(P< 0.05)。

表2 兩組基本情況統(tǒng)計(jì)

*與NC組比較，P< 0.05

2.2SNTB1基因SNP位點(diǎn)與高膽固醇血癥相關(guān)性分析SNTB1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型分布在病例組和對(duì)照組中均符合Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05，表3)，說明本研究資料具有群體代表性。其等位基因頻率在病例組和對(duì)照組之間具有顯著差異(rs7839488P= 0.0026，rsrs4395927P= 0.00014，rs4455882P= 0.0045，表3)，風(fēng)險(xiǎn)等位基因可以增加對(duì)高膽固醇血癥的易感性(OR值分別為1.28、1.36、1.25)，見表3。

表3 SNTB1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)在病例和對(duì)照組中風(fēng)險(xiǎn)等位基因頻率比較

* HWE：Hardy-Weinberg平衡；**P值和OR值為校正年齡、性別等參數(shù)之后的結(jié)果。

2.3連鎖不平衡和單倍體型分析采用Haploview 4.2 軟件對(duì)SNTB1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，這3個(gè)SNP位點(diǎn)均處在同一個(gè)連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)區(qū)域(圖1)。這3個(gè)位點(diǎn)可組成6個(gè)不同的單倍體型，其中風(fēng)險(xiǎn)單倍體型GCA可增加高膽固醇血癥患病風(fēng)險(xiǎn)34%(P= 0.00035)，而保護(hù)型單倍體型ATG可降低患病風(fēng)險(xiǎn)24%(P= 0.0021)。見表4。

圖1 SNTB1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)連鎖不平衡圖 圖中方塊的顏色深淺代表SNP位點(diǎn)之間的連鎖緊密程度。a：方塊中數(shù)字顯示的是SNP位點(diǎn)之間的D’值；b：方塊中數(shù)字顯示的是SNP位點(diǎn)之間的r2值

表4 SNTB1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍體型分析

3 討論

本研究基于遺傳因素基因多態(tài)性，研究SNTB1基因與高膽固醇血癥發(fā)病的關(guān)聯(lián)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNTB1基因上3個(gè)SNP位點(diǎn)(rs7839488、rs4395927和rs4455882)與四川地區(qū)漢族人群高膽固醇血癥發(fā)病顯著相關(guān)。

SNTB1基因位于染色體8q24.12區(qū)域，編碼β1互養(yǎng)蛋白(β1-syntrophin)，屬于互養(yǎng)蛋白家族成員之一?；ヰB(yǎng)蛋白家族與抗肌萎縮蛋白(dystrophin)復(fù)合物信號(hào)通路以及離子通道相關(guān)，在多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路受體的激活過程中起作用[10，11]。研究顯示，β1互養(yǎng)蛋白與ABCA1在人成纖維細(xì)胞相互結(jié)合，影響ABCA1的表達(dá)，并調(diào)控膽固醇代謝[8]。ABCA1(脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)膜蛋白1，ATP-binding cassette transporter 1)屬于ABC蛋白家族，可介導(dǎo)膽固醇流逝并調(diào)節(jié)新生HDL的形成[12]，在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著非常重要的作用[13，14]。ABCA1基因上多態(tài)位點(diǎn)可以影響其轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平，從而引起脂代謝紊亂[15，16]。

結(jié)合這些功能研究的結(jié)果和遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)以及我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明SNTB1基因多態(tài)位點(diǎn)有可能通過調(diào)控其轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)，使得其編碼蛋白-β1互養(yǎng)蛋白的水平發(fā)生改變，進(jìn)而影響與ABCA1的結(jié)合，參與膽固醇代謝的調(diào)節(jié)，從而影響高膽固醇血癥的易感性。由此可見，進(jìn)一步深入研究SNTB1基因上這些SNP位點(diǎn)在其表達(dá)過程中的具體調(diào)控作用模式，以及SNTB1編碼蛋白的功能，對(duì)于我們認(rèn)識(shí)高膽固醇血癥的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，同時(shí)也將有助于疾病的早期診斷、預(yù)防和靶向治療。