劉盼盼， 鄭鵬程， 郭桂義， 金孝芳， 尹 鵬， 高士偉， 王勝鵬， 葉 飛， 鄭 琳， 龔自明

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所/湖北省茶葉工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430064； 2.信陽農(nóng)林學(xué)院/河南省豫南茶樹資源綜合開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南信陽 464000)

茶葉中主要有奎尼酸、草酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、抗壞血酸、沒食子酸等近30種有機(jī)酸[1]。茶葉中的脂肪族有機(jī)酸對(duì)滋味的貢獻(xiàn)較大，而芳香族有機(jī)酸等是香氣的主要成分，它們?cè)诓枞~沖泡過程中大多數(shù)可被浸出到茶湯中，成為影響茶湯風(fēng)味品質(zhì)的主要成分之一[2]。眾多研究證實(shí)，有機(jī)酸有很強(qiáng)的抗氧化能力，對(duì)茶多酚、維生素等組分的抗氧化活性有明顯的增效作用[3-5]。有機(jī)酸作為食品添加劑也被廣泛用于果、蔬汁飲料中，其中檸檬酸、蘋果酸和酒石酸主要作為酸味劑，而抗壞血酸常作為抗氧化劑[6]。

目前，茶葉中有機(jī)酸的分析方法主要有酸堿滴定法、氣相色譜法、離子色譜法、毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜法等[7-10]。其中酸堿滴定法影響因素較多，準(zhǔn)確度較差；氣相色譜法需要在分離前對(duì)有機(jī)酸進(jìn)行衍生，樣品前處理繁瑣費(fèi)時(shí)且回收率低；離子色譜法由于對(duì)樣品中蛋白質(zhì)含量有嚴(yán)格的限定，不適合作復(fù)雜的樣品分析，且對(duì)低分子量有機(jī)酸檢測的準(zhǔn)確度不高；毛細(xì)管電泳法相對(duì)于其他分析方法來說，重現(xiàn)性存在明顯不足；高效液相色譜法具有靈敏度高、分離效果好的優(yōu)點(diǎn)，是目前有機(jī)酸分析中最成熟、也最常用的方法[11-12]。劉盼盼等研究了不同葉位、不同品種和不同茶類茶葉中有機(jī)酸的含量，以及不同沖泡條件下有機(jī)酸的浸出特性，結(jié)果表明奎尼酸、蘋果酸的含量較高，有機(jī)酸隨著鮮葉嫩度下降而減少，福鼎種的含量較低而黃金桂的含量最高，紅茶中有機(jī)酸含量最高[1]。黎爽等建立了白茶中8種有機(jī)酸的HPLC方法，檢測結(jié)果顯示，乙酸是白茶中的主要有機(jī)酸，有機(jī)酸總量隨著鮮葉等級(jí)的降低呈下降趨勢[13]。趙和濤研究表明，紅茶經(jīng)過萎凋、揉捻、發(fā)酵等加工工序后，有機(jī)酸總量呈增長趨勢，如水楊酸等有機(jī)酸，鮮葉中含量為29.60%，萎凋葉中含量為 32.21%，發(fā)酵葉中含量為43.82%，直至干燥時(shí)才有所降低[14]。謝嬌枚等對(duì)祁門紅茶進(jìn)行品質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，在長時(shí)間的存放過程中，祁門紅茶的酸類物質(zhì)總量增加明顯，但各有機(jī)酸組分含量均有所改變，如草酸、乙酸等物質(zhì)含量顯著增加，而檸檬酸明顯降低，使得茶湯滋味變酸且口感變差[15]。

目前，有關(guān)福鼎大白和中茶108品種鮮葉在不同生長期內(nèi)有機(jī)酸含量的變化尚未見報(bào)道，本研究通過優(yōu)化色譜條件，建立了采用高效液相色譜法檢測茶葉中10種有機(jī)酸的測定方法，分析比較了福鼎大白和中茶108品種鮮葉在不同生長期內(nèi)有機(jī)酸含量的變化規(guī)律，為茶葉加工工藝優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

材料均采自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所金水基地茶園，于2016年4月，根據(jù)不同茶樹品種萌動(dòng)期20 d后每隔一段時(shí)間采摘中茶108和福鼎大白2個(gè)茶樹品種的新梢部分，先進(jìn)行微波殺青，然后80 ℃烘干固樣，磨碎后裝入鋁箔袋，低溫儲(chǔ)藏。不同采摘日期見表1。

H3PO4(色譜純)，天津科密歐化學(xué)試劑公司；KH2PO4(分析純)，阿拉丁試劑；草酸、奎尼酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、莽草酸、抗壞血酸、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，源葉生物有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀，2998 PDA檢測器；Milli-RO PLUS 30純水機(jī)，法國Millipore公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別稱取草酸、奎尼酸、酒石酸、蘋果酸20 mg，乳酸10 mg，檸檬酸、琥珀酸、莽草酸20 mg，抗壞血酸10 mg，沒食子酸20 mg至10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度配制成混標(biāo)儲(chǔ)備液。混標(biāo)中上述各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為2.0、2.0、2.0、2.0、1.0、2.0、2.0、2.0、1.0、2.0 mg/mL。分別量取混標(biāo)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm濾膜過濾后，得到不同濃度的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

表1 茶樹品種及生長期對(duì)有機(jī)酸含量影響的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2 樣品前處理 稱取3.0 g磨碎茶于錐形瓶中，用 450 mL 純凈水沖泡，在沸水浴鍋中浸提45 min，抽濾至 500 mL 容量瓶中，冷卻后定容，用0.22 μm的膜過濾，分析有機(jī)酸含量。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：Atlantis T3 Column(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.02 mol/L磷酸二氫鉀(用磷酸調(diào)pH值至2.8)，流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測器波長210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測有機(jī)酸色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長的選擇 本研究采用二極管陣列檢測器(DAD)進(jìn)行檢測，混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣后對(duì)各有機(jī)酸的DAD圖譜進(jìn)行分析：在190～400 nm波長范圍內(nèi)，有機(jī)酸的吸收強(qiáng)度基本呈現(xiàn)先上升而后下降趨勢，發(fā)現(xiàn)在210 nm處均有較大吸收峰，且基線穩(wěn)定、噪音小。因此，確定檢測有機(jī)酸的波長為210 nm。

2.1.2 流動(dòng)相濃度、流速、pH值選擇 磷酸鹽緩沖溶液是最典型適用的洗脫液，在紫外區(qū)幾乎無吸收，常作為有機(jī)酸測定的流動(dòng)相[13]。本試驗(yàn)以磷酸二氫鉀為流動(dòng)相，考察了0.02、0.05、0.1、0.2 mol/L 4個(gè)不同濃度對(duì)有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)出峰時(shí)間和分離度無明顯變化(圖1)，但是高濃度磷酸鹽容易在儀器和色譜柱中結(jié)晶析出，因此，確定采用0.02 mol/L磷酸二氫鉀為流動(dòng)相。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與線性范圍考察

將各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)試劑分別配成單一的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在同一色譜條件下分別進(jìn)樣，確定每種有機(jī)酸的保留時(shí)間，根據(jù)保留時(shí)間定性。然后將不同濃度的有機(jī)酸單標(biāo)混合成混標(biāo)溶液，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，計(jì)算各自的峰面積(每個(gè)樣平行進(jìn)樣3次)。按試驗(yàn)結(jié)果繪制各有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以色譜峰面積為橫坐標(biāo)(X)，有機(jī)酸濃度為縱坐標(biāo)(Y)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(表2)。10個(gè)有機(jī)酸峰面積和濃度的相關(guān)系數(shù)在0.991 8～0.999 6之間，在一定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及精密度分析

2.3 方法回收率

選擇108-1樣品作為加標(biāo)基質(zhì)，重復(fù)添加3次，10種有機(jī)酸的加標(biāo)回收率為95.33%～101.42%(表3)，表明該處理樣品的方法具有較高的回收率，適合對(duì)茶葉中有機(jī)酸檢測分析。

2.4 樣品中有機(jī)酸含量

使用優(yōu)選的色譜條件對(duì)20個(gè)茶葉樣品分別進(jìn)行檢測，不同茶樹品種不同生長階段有機(jī)酸含量見表4。從表4可以看出，共檢出10個(gè)有機(jī)酸組分，中茶108、福鼎大白2個(gè)品種樣品的有機(jī)酸總量的平均值相近，在生長期內(nèi)均呈先增加后減少的趨勢，但中茶108樣品在60 d時(shí)有機(jī)酸總量最高，為 57.98 g/kg；福鼎大白樣品在30 d時(shí)有機(jī)酸總量最高，為 68.55 g/kg。中茶108、福鼎大白2個(gè)品種在不同生長期奎尼酸、沒食子酸、檸檬酸平均含量最多，分別為20.24、8.66、5.68 g/kg，分別占有機(jī)酸總量的43.81%、18.75%和 12.29%。乳酸含量最低，尤其是在大部分福鼎大白樣品中未檢出?？崴帷⒚Р菟嵩谏L期內(nèi)與有機(jī)酸總量的變化趨勢含量為 46.21 g/kg， 以奎尼酸、沒食子酸、檸檬酸平均含量較一致，而蘋果酸與抗壞血酸在生長期內(nèi)呈持續(xù)減少趨勢，草酸相對(duì)穩(wěn)定，其他有機(jī)酸變化無明顯規(guī)律。

表3 有機(jī)酸回收率試驗(yàn)

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)茶葉中有機(jī)酸的檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了以0.02 mol/L磷酸二氫鉀(pH值2.8)為流動(dòng)相，Atlantis T3 Column為色譜柱，10種有機(jī)酸，即草酸、奎尼酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、莽草酸、抗壞血酸、沒食子酸在 210 nm 處得到完全分離。對(duì)不同品種茶葉在不同生長期階段的有機(jī)酸進(jìn)行了檢測分析，結(jié)果表明，中茶108和福鼎大白品種鮮葉含有的有機(jī)酸種類無明顯差異，10種有機(jī)酸均有檢出。樣品各自的有機(jī)酸總量可達(dá)到22.12～68.55 g/kg，平均含量為 46.21 g/kg， 以奎尼酸、沒食子酸、檸檬酸平均含量較高，分別為20.24、8.66、5.68 g/kg。有機(jī)酸是茶葉品質(zhì)成分的重要組成部分，與茶葉品質(zhì)的相關(guān)性還未開展系統(tǒng)研究。不同茶樹品種、不同生長期的有機(jī)酸種類和含量均有一定差異，因此，今后要明確各種有機(jī)酸組分對(duì)茶葉品質(zhì)的影響，有針對(duì)性地選擇適宜的茶樹品種，在最佳生長期內(nèi)采摘鮮葉進(jìn)行加工，為茶葉品質(zhì)的提高提供理論依據(jù)。

表4 不同茶樹品種在不同生長階段的有機(jī)酸含量

注：ND表示未檢出。