蔡丙嚴(yán)， 田其真， 戴建華， 劉 莉， 郝福星， 李 雅

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌極易感染2～4月齡的豬，臨床上稱為豬傳染性胸膜肺炎，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為出血性纖維素性胸膜肺炎，可造成豬的突然死亡，給規(guī)?；i場造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。該病現(xiàn)已在世界上許多國家和地區(qū)普遍存在[2]，近年來我國中小規(guī)模的養(yǎng)豬場，尤其是商品豬育肥的中后期多發(fā)[3]，同時，豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌對現(xiàn)有抗生素極易產(chǎn)生耐藥性[4]，而現(xiàn)有疫苗多為針對某種血清型的單價或多價苗，不能滿足對所有血清型的免疫[5]。伴隨市場對綠色無公害豬肉產(chǎn)品的需求，尋求開發(fā)具有顯著治療效果的藥物具有重要的臨床意義。我國中藥資源豐富，中醫(yī)藥文化博大精深，而中獸藥制劑對豬病的防控已成為當(dāng)今獸醫(yī)臨床上研究的熱點[6]。現(xiàn)代中藥藥理研究結(jié)果表明，部分清熱解毒功效的中藥具有抑制多種病原微生物的作用[7]。為了篩選臨床上具有顯著抑制豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌活性的中藥并進(jìn)行組方，筆者所在項目組收集了13種具有清熱解毒功效的中藥，采用水提法制備中藥藥液，對臨床上分離得到的有致病性的豬傳染性胸膜肺炎桿菌進(jìn)行體外藥敏試驗，篩選出有顯著抑菌活性的五倍子、野拔子、大黃連等3種單味中藥和五倍子與野拔子的1個中藥復(fù)方，以期為后期研制抑制豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的復(fù)方中藥制劑、探索中藥防治豬傳染性胸膜肺炎奠定試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以江蘇省某豬場提供的病豬肺臟作為病樣，經(jīng)江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院豬病檢測中心分離鑒定為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌致病菌株，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

翻白草、野拔子、虎杖、透骨草、癩蛤蟆草、小黃連等13種中藥，采自海拔約1 700 m處的云南祿勸彝族苗族自治縣，為當(dāng)?shù)匾吧幉模?jīng)當(dāng)?shù)厮帣z部門鑒定為地道中藥材。

胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptic soy agar，簡稱TSA)培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth，簡稱TSB)培養(yǎng)基，均購自碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，簡稱NAD)，購自Roche公司；無支原體犢牛血清購于江蘇晶美生物科技有限公司。

電子天平(Sartorius)、氣浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱(JY92-IID)、超凈工作臺(AH-100)、CO2培養(yǎng)箱(HF151)均購自南京瑤恩儀器設(shè)備儀器有限公司；電子萬用爐，購自西安廣大電爐有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 中藥水煎液制備 分別稱取25 g五倍子、小黃連、大黃連、野拔子、金銀花、馬鞭梢、透骨草、苧麻、虎杖、翻白草、清于膽草、冬凌草、癩蛤蟆草等13種中藥，置于100 mL蒸餾水中浸泡1 h，在萬用爐上用大火加熱至煮沸，改為文火煮 30 min，文火時要保持微沸狀態(tài)，收集第1次的煎液，繼續(xù)加100 mL水，同法煎制，30 min后收集，將2份煎液混勻，濾紙過濾，加熱濃縮至濃度為1 g/mL，用2%～4% NaOH溶液調(diào)節(jié)藥液的pH值為7.2～7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 TSA培養(yǎng)基平板與TSB菌液制備 參照文獻(xiàn)[8]，制備TSA培養(yǎng)基平板及TSB液體培養(yǎng)基，均加入0.02% NAD和5%犢牛血清，置于4 ℃冰箱備用。取0.1 mL已分離鑒定保存的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌，接種于TSB液體培養(yǎng)基，在37 ℃氣浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱中150 r/min培養(yǎng)8 h，最后將細(xì)菌濃度稀釋至106～107CFU/mL，即用。

1.2.3 單味藥及部分復(fù)方中藥藥敏試驗 用新華定性濾紙打孔制成直徑為6 mm的藥敏紙片，分裝于藥敏瓶，每瓶50片，121 ℃ 高壓滅菌15 min，烘干后加入1 mL制備好的單味藥液，中藥濃度為20 μg/片，浸泡2 h后烘箱烘干，放入 -20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。將培養(yǎng)好的菌液取0.1 mL用涂布棒均勻涂布在TSA固體培養(yǎng)基上，待其干燥，將藥敏紙片貼在平皿上，放入CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃恒溫培養(yǎng)36～48 h，觀察結(jié)果，測量含藥紙片抑菌圈直徑。根據(jù)抑菌圈直徑大小，選取敏感度較高的單味藥液制成復(fù)方，各取0.5 mL混勻加入紙片瓶中，其他步驟同單味藥，觀察結(jié)果。

1.2.4 最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，簡稱MIC)測定 選擇對豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌有中度敏感以上的單味中藥及復(fù)方，采用二倍稀釋法[9]測定MIC。在無菌條件下，取10支高壓滅菌過的試管，1～9支為試驗組，第10支為對照組。分組編號后向1～10管中各加1 mL TSB液體培養(yǎng)基，吸取1 mL藥液加入第1管，混勻后吸取1 mL加入第2管，依次至第9管，混勻后棄去1 mL，此時試管內(nèi)藥液質(zhì)量濃度分別為500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.60、7.80、3.90、1.95 mg/mL，第10管不加藥物。用微量移液器取0.1 mL菌液加入1～10管中，充分搖勻，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)18～24 h后，分別觀察細(xì)菌的生長狀況并作好記錄。若試驗管中溶液渾濁，則表示細(xì)菌生長狀況良好，該濃度藥液沒有抑菌作用；如果試驗管中沒有渾濁，則說明豬胸膜肺炎放線桿菌的生長受到了抑制，此時的藥液稀釋濃度即為該藥物的最小抑菌濃度。

1.2.5 最小殺菌濃度(minimum bactoricidal concentration，簡稱MBC) 依據(jù)MIC測定的結(jié)果，繼續(xù)培養(yǎng)試驗管至48 h，在試驗組中取出沒有生長細(xì)菌的試管，用微量移液器吸取 0.1 mL 用涂布棒涂布于TSA培養(yǎng)基平板上，于37 ℃培養(yǎng) 24～36 h，觀察結(jié)果，以細(xì)菌菌落個數(shù)不超過5個的管內(nèi)藥物濃度為該藥的最小殺菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單味藥及部分復(fù)方中藥藥敏試驗結(jié)果

13種單味中藥及2種復(fù)方中藥體外抑制豬傳染性胸膜肺炎的藥敏試驗結(jié)果見表1。

由表1可知，五倍子、野拔子、大黃連等3種單味中藥對豬胸膜肺炎放線桿菌有明顯的抑制作用，尤其是對五倍子表現(xiàn)為高度敏感。對金銀花、透骨草、清魚膽草、翻白草、苧麻根、虎杖、冬凌草、癩蛤蟆草等表現(xiàn)為低度敏感，對小黃連、馬鞭梢則不敏感。五倍子與野拔子、五倍子與大黃連2種復(fù)方中藥對豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抑制作用優(yōu)于單味五倍子、大黃連，中藥復(fù)方后2種藥物有協(xié)同作用，藥效有所增強(qiáng)。

表1 單味藥及部分復(fù)方中藥藥敏試驗結(jié)果

注：豬胸膜肺炎放線桿菌藥敏試驗的抑菌圈直徑標(biāo)準(zhǔn)：>20 mm為極度敏感；15～20 mm為高度敏感；10～14 mm為中度敏感；<10 mm 為低度敏感；無抑菌圈的為不敏感[10]。

2.2 最小抑菌濃度與最小殺菌濃度測定結(jié)果

由表2可知，五倍子與野拔子中藥復(fù)方的MIC與MBC分別為3.90、7.80 mg/mL，對豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌有明顯的體外抑制作用，屬高度敏感藥物。五倍子單味中藥、五倍子與大黃連中藥復(fù)方兩者之間的MIC與MBC結(jié)果相同，分別為7.80、15.60 mg/mL，同屬高度敏感藥物。單味中藥野拔子、大黃連兩者之間的MIC與MBC相同，分別為31.25、62.50 mg/mL，屬于中度敏感藥物。上述藥物MIC與MBC測定結(jié)果與抑菌圈直徑測量結(jié)果基本一致。

3 討論與結(jié)論

本研究所選五倍子、野拔子、大黃連等均為清熱解毒類中藥，具有較顯著的體外抗菌活性。其中，五倍子有清肺、解毒的功效，可治肺虛咳嗽、下痢、腹泄，對變形桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌、肺炎球菌均有抑制作用[12]。野拔子是云南地區(qū)的一種藥食同源植物，具有疏風(fēng)解表、利濕、消食化積的功效，研究表明其粗提液對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌有較好的抑制效果[13]。大黃連為毛茛科植物黃連、三角葉黃連或云連的干燥根莖，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，現(xiàn)代藥理研究表明，其對多種細(xì)菌、真菌以及病毒均有較好的拮抗作用[14]。本研究結(jié)果顯示，五倍子、野拔子、大黃連等3種單味中藥對豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌具有明顯的體外抑菌活性，尤其是五倍子，為高度敏感藥物，抑菌圈直徑為15 mm。以五倍子為主藥分別配伍野拔子、大黃連組成的復(fù)方中藥，其對豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的抑菌活性比單味中藥有所增強(qiáng)，兩者配伍有協(xié)同抑菌作用。

表2 單味中藥及復(fù)方MIC與MBC測定結(jié)果

注：“-”表示細(xì)菌未生長；“+”表示細(xì)菌生長。判定標(biāo)準(zhǔn)：MIC≤7.80 mg/mL為高度敏感；7.80 mg/mL

本研究所選的13種中藥對豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的體外抑制作用，與康帥報道的20種中藥對豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的抑菌活性中，黃連、虎杖等為中度敏感藥物的結(jié)論[15]較為一致。劉仁志等報道，大蒜揮發(fā)油及其復(fù)方對豬胸膜肺炎放線桿菌的最低抑菌濃度為3.90 mg/mL，最低殺菌濃度為7.80 mg/mL[16]，本次試驗中五倍子與野拔子復(fù)方的MIC、MBC與之相一致。中藥體外抑菌活性試驗結(jié)果受眾多因素如試驗手段、條件、中藥批次、提取方式不同等的影響，因此在進(jìn)行相關(guān)試驗時要采取科學(xué)的試驗方法、統(tǒng)一的測定標(biāo)準(zhǔn)，以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌感染已成為養(yǎng)豬業(yè)的一大威脅，在一定程度上阻礙了育肥豬的健康養(yǎng)殖。目前臨床上主要治療方法是注射頭孢噻呋、氟苯尼考等廣譜抗生素，由于不按療程、盲目加大劑量等不規(guī)范用藥，使該菌產(chǎn)生了一定的耐藥性，治療效果已不明顯，且過多抗生素在豬體內(nèi)蓄積，亦嚴(yán)重危害人類健康。眾多研究結(jié)果表明，中藥在防治豬胸膜肺炎放線桿菌上具有較好的療效，并且已經(jīng)取得一定的成果。本研究所篩選的中藥五倍子與野拔子復(fù)方，體外具有顯著的抑殺豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌活性，為后續(xù)臨床療效奠定了基礎(chǔ)。研發(fā)以五倍子與野拔子為主藥的中藥制劑，對臨床防治豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌具有廣闊的應(yīng)用前景。