吳松成， 韓 雪， 陳 林， 伍革民， 粟朝芝， 朱麗莉， 陶宇航

(1.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽 550005； 2.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽貴州 550025)

催乳素(prolactin，PRL)是由腺垂體催乳素細(xì)胞合成和分泌的一種肽類激素，主要作用于動(dòng)物的性腺和乳腺，催乳素與其受體(prolactin receptor，PRLR)結(jié)合后作用于靶細(xì)胞，調(diào)節(jié)繁殖相關(guān)激素的分泌，促進(jìn)基因表達(dá)[1-3]。利用PRLR基因的作用機(jī)制，將其作為影響動(dòng)物繁殖性能的候選基因有著重要意義。近年來，越來越多的研究者對(duì)催乳素受體基因進(jìn)行大量報(bào)道，劉遠(yuǎn)等報(bào)道，PRLR基因的優(yōu)勢(shì)基因型個(gè)體能夠顯著提高大白豬的窩產(chǎn)仔數(shù)[4]；張陳華等研究指出，PRLR基因的多態(tài)性對(duì)圩豬和定遠(yuǎn)豬的產(chǎn)仔數(shù)有一定影響[5]；Tomas等發(fā)現(xiàn)，PRLR基因外顯子突變能夠顯著影響豬的排卵率和仔豬存活率[6]；Chu等認(rèn)為，PRLR基因與羊的產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)[7-8]。但是以上的研究均是對(duì)家畜的研究報(bào)道，對(duì)于家禽的研究甚少。洪坤月報(bào)道，PRLR基因多態(tài)性對(duì)雞的早期平均蛋質(zhì)量有一定的影響，而對(duì)開產(chǎn)日齡、蛋型指數(shù)、早期產(chǎn)蛋量等影響不顯著(P>0.05)[9]。百宜黑雞是貴州省的優(yōu)良地方品種，但由于近年來外來品種的引進(jìn)，加之農(nóng)戶的粗放型飼養(yǎng)，人為因素過強(qiáng)地干預(yù)選育，百宜黑雞品種資源岌岌可危。本試驗(yàn)以百宜黑雞為研究對(duì)象，以期尋找有效的分子遺傳標(biāo)記，為該品種進(jìn)一步的開發(fā)利用、保種等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

百宜黑雞由貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)百宜鄉(xiāng)貴州農(nóng)農(nóng)農(nóng)生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司的種雞場(chǎng)提供。隨機(jī)抽取同一日齡、相同飼養(yǎng)管理水平的95羽百宜黑雞雞翅靜脈采血5 mL/羽，EDTA抗凝，放冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于基因組DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 試驗(yàn)采用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]分別對(duì)95羽百宜黑雞血液中基因組DNA抽提，并用Thermo Fisher微量紫外分光光度計(jì)對(duì)所獲得的DNA進(jìn)行濃度和純度測(cè)定，1.0% 瓊脂糖凝膠檢測(cè)其完整性。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank發(fā)布的家雞PRLR基因序列(登錄號(hào)：NC_006127.4)，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0對(duì)雞PRLR基因設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，分別對(duì)外顯子3(PRLR-1)和外顯子6(PRLR-2)進(jìn)行擴(kuò)增，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，引物信息見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用30 μL體系：上、下游引物各2 μL，DNA模板3 μL，2×TaqPCR Master Mix 14 μL，雙蒸水9 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，退火35 s(退火溫度詳見表1)，72 ℃延伸40 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

表1 百宜黑雞PRLR基因擴(kuò)增引物詳細(xì)信息

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，DNAstar進(jìn)行序列分析比對(duì)，用SPSS 18.0中GLM模型對(duì)不同基因型與產(chǎn)蛋性能間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”體現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物檢測(cè)

以百宜黑雞基因組DNA為模板，分別對(duì)2對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目的條帶與預(yù)期結(jié)果一致，且引物特異性良好，PCR產(chǎn)物無須純化可直接用于測(cè)序(圖1)。

2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序及序列分析

根據(jù)目的片段擴(kuò)增結(jié)果，將PCR產(chǎn)物全部送往北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行直接測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAstar拼接并與GenBank發(fā)布的家雞PRLR基因序列進(jìn)行校正、比對(duì)，結(jié)果在試驗(yàn)群體的PRLR基因中發(fā)現(xiàn)只存在1個(gè)SNP位點(diǎn)(圖2)，在百宜黑雞PRLR基因外顯子3的36 bp位置發(fā)生了C/T突變(36C/T)，然而外顯子6區(qū)域并未找到突變位點(diǎn)。

2.3 百宜黑雞PRLR基因遺傳特性分析

測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)群體的PRLR基因中找到了1個(gè)SNP，根據(jù)這個(gè)SNP位點(diǎn)將其對(duì)應(yīng)的純合子和雜合子命名為CC型和CT型。根據(jù)表2統(tǒng)計(jì)的結(jié)果可知，該位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因型CC基因型為優(yōu)勢(shì)基因型(0.957 9)，等位基因C為優(yōu)勢(shì)等位基因(0.978 9)。χ2適合性檢驗(yàn)表明，該基因座的位點(diǎn)不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.05)；PIC=0.041 7<0.25，屬于低度多態(tài)。

表2 百宜黑雞PRLR基因多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率

2.4 PRLR基因與產(chǎn)蛋性能關(guān)聯(lián)分析

根據(jù)SNP分型的結(jié)果，對(duì)不同基因型與產(chǎn)蛋性能間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，百宜黑雞PRLR基因36C/T位點(diǎn)與產(chǎn)蛋性能的顯著性關(guān)系分析結(jié)果如表3所示，由表3可知，任何一種基因型與總蛋個(gè)數(shù)以及蛋均質(zhì)量之間均不呈顯著關(guān)系(P>0.05)。

表3 PRLR基因多態(tài)位點(diǎn)與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析

3 討論與結(jié)論

由于生產(chǎn)性能直接決定著經(jīng)濟(jì)效益，因此對(duì)養(yǎng)殖戶或者育種家來說，在追求動(dòng)物快速增長的同時(shí)更加注重其生產(chǎn)性能。王健等研究表明，鵝PRLR基因的表達(dá)受PRL基因的調(diào)控[10]；高天等研究表明，PRLR基因多態(tài)性極顯著影響嘉興黑豬的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、死胎數(shù)和初生均質(zhì)量(P<0.01)[11]；孫延曉等研究發(fā)現(xiàn)，PRLR基因?qū)ωi的平均窩產(chǎn)數(shù)有影響[12]；洪月坤報(bào)道，PRLR基因外顯子3多態(tài)性對(duì)雞的產(chǎn)蛋性能無影響[9]。由此可見，不同的物種或品種得出的結(jié)論是不一致的。本研究以百宜黑雞為研究對(duì)象，在試驗(yàn)群體的PRLR基因的外顯子3發(fā)現(xiàn)了1個(gè)SNP，χ2適合性檢驗(yàn)表明，該基因座的位點(diǎn)不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.05)，這可能是抽樣誤差、樣本數(shù)較少造成的，也有可能是人工過度選育結(jié)果所致。將該突變位點(diǎn)與總蛋數(shù)和平均蛋質(zhì)量進(jìn)行顯著性分析發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)的任何一種基因型對(duì)這2項(xiàng)生產(chǎn)數(shù)據(jù)均不顯著，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果[9]有一定的相似之處，但尚不清楚是品種原因還是基因特性，因此，筆者所在課題組今后將會(huì)加大樣本數(shù)量和雞品種進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。本試驗(yàn)結(jié)果為后期原核或真核表達(dá)載體的構(gòu)建提供了理論依據(jù)，對(duì)百宜黑雞品種的開發(fā)利用、保種選育提供了理論資料。