袁 圓， 張愛(ài)民， 王永平， 梁傳靜， 廖芳芳， 吳康云， 張 明， 邢 丹

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院辣椒研究所，貴州貴陽(yáng) 550006； 2.中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550002)

辣椒是貴州地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。遵義市地處貴州省北部，處于云貴高原向湖南丘陵和四川盆地過(guò)渡的斜坡地帶，地形起伏大，地貌類型復(fù)雜，海拔高度一般在800～1 300 m，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，終年溫涼濕潤(rùn)，冬無(wú)嚴(yán)寒、夏無(wú)酷暑，雨量充沛，日照充足，全境可以種植辣椒，是全國(guó)聞名的辣椒主要種植區(qū)，擁有全國(guó)最大的辣椒集散交易中心，辣椒品質(zhì)在全國(guó)名列前茅。近年來(lái)在當(dāng)?shù)卣姆龀窒拢苯芬?guī)模逐年增加，至2016年種植規(guī)模為13萬(wàn)多hm2，占全省辣椒種植總面積的48%，主要種植品種有圓顆粒、小米椒、子彈頭、二荊條等[1]。

辣椒在連年栽培的過(guò)程中受連作障礙的嚴(yán)重威脅，其產(chǎn)量及品質(zhì)降低?；形镔|(zhì)的累積是產(chǎn)生辣椒連作障礙的主要因素之一，也是辣椒集約化發(fā)展的一個(gè)瓶頸，研究發(fā)現(xiàn)，在連作栽培中辣椒根系會(huì)分泌一些化感物質(zhì)，譬如酚酸類物質(zhì)，這些酚酸物質(zhì)會(huì)隨著連作時(shí)間的增加在土壤中不斷富集，進(jìn)而抑制辣椒植株生長(zhǎng)。此外，上茬作物收獲后，其殘留植物體的分解也會(huì)釋放部分酚酸物質(zhì)，不利于辣椒植株的生長(zhǎng)。酚酸物質(zhì)的累積可為土壤中病原微生物提供碳源，降低土壤pH值，影響植株對(duì)養(yǎng)分和水分的攝取，進(jìn)而導(dǎo)致植株抵抗力下降，為病原菌的侵入創(chuàng)造有利條件，從而引起土傳病害的大暴發(fā)，危害辣椒的產(chǎn)量以及品質(zhì)。研究表明，植物所釋放的化感物質(zhì)可歸為以下幾類：水溶性有機(jī)酸類、不飽和內(nèi)酯、脂肪酸和多炔、醌類物質(zhì)、酚類、苯甲酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、香豆素類；類黃酮、單寧、類萜和甾類化合物、氨基酸和多肽、生物堿和氰醇、硫化物和芥子油苷、嘌呤和核苷等[2]。目前有關(guān)遵義市連作辣椒根際周圍化學(xué)成分鑒定與動(dòng)態(tài)變化研究的相關(guān)報(bào)道較少，本研究通過(guò)分析不同辣椒品種、生育期及種植年限的根系及土壤化學(xué)成分，結(jié)合已被廣泛報(bào)道具有化感作用的組分，剖析遵義市辣椒主產(chǎn)區(qū)辣椒根系與根際土壤主要化學(xué)成分及潛在的化感物質(zhì)種類及積累情況，旨在為深入研究辣椒化感物質(zhì)與自毒作用提供參考，為更好更快地解決辣椒連作障礙提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 選擇黔椒5號(hào)(線椒)、辣研2號(hào)(朝天椒)、綏陽(yáng)小米辣(本地品種)3個(gè)品種作為供試材料，其中黔椒5號(hào)和辣研2號(hào)分別為貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所和貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)辣椒研究所選育的雜交品種，綏陽(yáng)小米辣為當(dāng)?shù)刈粤舴N。

1.1.2 供試儀器 HP6890/5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)(美國(guó)安捷倫科技公司)、EYELA N—1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會(huì)社)、SHB-Ⅲ 循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、KQ300DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 田間小區(qū)設(shè)計(jì) 將3個(gè)辣椒品種[黔椒5號(hào)(線椒)、辣研2號(hào)(朝天椒)、綏陽(yáng)小米辣(本地品種)]分別種植在面積為667 m2的連作地(連續(xù)種植辣椒10年)和非連作地(第1年種植辣椒)里，其中每塊地均分為3個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)按隨機(jī)區(qū)組對(duì)3個(gè)辣椒品種進(jìn)行排列種植，每個(gè)品種種植60株，生長(zhǎng)期內(nèi)采用相同的栽培措施及管理模式。

1.2.2 樣品采集 于2016年7—8月(辣椒盛花期和盛果期)采集遵義市永樂(lè)鎮(zhèn)辣椒連作地及非連作地辣椒根系及根際土壤，按照五點(diǎn)取樣法，分別選擇黔椒5號(hào)(線椒)、辣研2號(hào)(朝天椒)、綏陽(yáng)小米辣(本地品種)3個(gè)品種進(jìn)行采樣，并帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行GC-MS化學(xué)成分鑒定與分析。

1.2.3 樣品前處理 將土樣和根系樣品放置在陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干，然后將土樣研磨后過(guò)40目篩備用，根系樣品粉碎后備用。分別稱取4 g土壤樣品和1 g根部樣品，加入20 mL提取液(甲醇 ∶乙酸乙酯=1 ∶1)浸提，于超聲清洗機(jī)超聲2次(每次30 min)后放置過(guò)夜。將浸提液于3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，將樣品溶劑部分于35 ℃減壓濃縮，土壤樣品加200 μL甲醇溶解，根系樣品加2 mL甲醇溶解，于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.4 樣品檢測(cè) 采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀鑒定樣品化學(xué)成分，進(jìn)樣量為2 μL。

檢測(cè)條件：色譜柱為AB-INOWAX(30 m×0.25 μm×0.25 mm)毛細(xì)管柱。程序升溫：初始溫度40 ℃(保持 2 min)，以5 ℃/min升溫至240 ℃后，保持16 min。運(yùn)行時(shí)間：58 min，汽化室溫度為250 ℃，載氣為高純He(99.999%)，柱前壓為7.65 psi，載氣流量為1.0 mL/min，不分流。溶劑延遲時(shí)間：5.0 min。

質(zhì)譜條件：離子源為電子轟擊離子源(EI)，離子源溫度為230 ℃，四級(jí)桿溫度為150 ℃，電子能量為70 eV，發(fā)射電流為34.6 μA，倍增器電壓為 1 812 V，接口溫度為280 ℃，質(zhì)量范圍為29～500 amu。

化學(xué)成分鑒定：對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì)Nist2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，檢索出相應(yīng)的物質(zhì)，確定化學(xué)成分，并通過(guò)峰面積歸一化法測(cè)定各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而得到不同物質(zhì)及組分在根際及土壤中的百分?jǐn)?shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒根際土壤化學(xué)成分鑒定與分析

由表1可知，7月辣椒盛花期根際土壤浸提液共檢測(cè)出14類46種物質(zhì)，其中烷類2種、酯類6種、酸類1種、酚類1種、醇類16種、酮類4種、醛類7種、酰胺類3種、其他類6種。所檢測(cè)出物質(zhì)的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在不同處理中存在一定的差異，其中綏陽(yáng)小米辣連作地土壤中的醇類物質(zhì)相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和高達(dá)54.85%，明顯高于其非連作地及黔椒5號(hào)、辣研2號(hào)2個(gè)品種連作地和非連作地土壤中的含量；在同一辣椒品種中，醛類物質(zhì)總的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)整體呈現(xiàn)出非連作地比連作地高的趨勢(shì)，其中香草醛是已被報(bào)道的化感物質(zhì)[3-5]，在連作條件下檢測(cè)出綏陽(yáng)小米辣根際土壤所占的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.67%，在非連作地沒(méi)有被檢出；酸類物質(zhì)中棕櫚酸在綏陽(yáng)小米辣非連作地的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.76%，在其余5個(gè)處理中沒(méi)有被檢出。棕櫚酸甲酯[6-12]、γ-丁內(nèi)酯[13]、苯甲醛[14-15]、苯并噻唑[16-17]已在煙草等作物上報(bào)道具有化感作用，本研究在辣椒土壤也有檢出，但是含量較少。

由表2可知，8月辣椒盛果期土壤浸提液共檢測(cè)出14類56種物質(zhì)，比7月盛花期多10種物質(zhì)，其中酸類物質(zhì)檢測(cè)出有9種，比7月多8種；醛類檢測(cè)出9種，比7月盛花期增加2種物質(zhì)，并檢出酯類7種、酚類1種、醇類16種、酮類4種、酰胺類3種、其他類7種，可以看出，醇類、醛類、酸類數(shù)量較多，酮類、酯類次之。在綏陽(yáng)小米辣連作地中，酸類物質(zhì)的總相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45.78%，十七(烷)酸、十八(烷)酸/硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸/十八烯酸、亞油酸、棕櫚酸[6-12]等物質(zhì)都被證實(shí)具有化感作用，其中棕櫚酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為 28.43%；相比連作地，綏陽(yáng)小米辣非連作地均未檢出相應(yīng)物質(zhì)。雜交品種黔椒5號(hào)(線椒)在連作地及非連作地土壤中未檢測(cè)出酸類物質(zhì)，雜交品種辣研2號(hào)(朝天椒)僅在非連作地土壤里檢測(cè)出棕櫚酸。醛類物質(zhì)相比7月共同含有的物質(zhì)有對(duì)羥基苯甲醛、二甲基縮醛、4-甲基苯甲醛、苯甲醛、糠醛。由表2可知，辣椒盛果期沒(méi)有烷類物質(zhì)被檢出，醛類物質(zhì)在綏陽(yáng)小米辣中，非連作地的總相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯比連作地高，在黔椒5號(hào)、辣研2號(hào)中卻是相反。

2.2 辣椒根系化學(xué)成分鑒定與分析

由表3可知，盛花期根系浸提液共檢測(cè)出13類77種物質(zhì)，其中酸類21種、酯類9種、酚類5種、醇類16種、酮類7種、醛類8種、酰胺類4種、其他類6種，酸類物質(zhì)數(shù)量占到總檢測(cè)數(shù)目的27.27%，醇類次之，占20.78%，酚、酸類共占 33.77%。根系浸出液中總相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的為酸類，綏陽(yáng)小米辣、黔椒5號(hào)、辣研2號(hào)非連作地和連作地中的占比分別為71.58%和76.93%、63.12%和80.08%、78.96%和 68.38%，可以看出，連作地含量高于非連作地的品種有綏陽(yáng)小米辣和黔椒5號(hào)。3個(gè)辣椒品種中酯類物質(zhì)相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)整體呈現(xiàn)出連作地比非連作地高的規(guī)律。酚類物質(zhì)中3個(gè)辣椒品種非連作地、連作地共有的物質(zhì)為4-乙烯基-2-甲氧基苯酚。醛類物質(zhì)中連作地比非連作地相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高的品種為綏陽(yáng)小米辣和黔椒五號(hào)，香草醛除了在綏陽(yáng)小米辣非連作地未被檢出，在其余5個(gè)處理中均檢出，且連作地含量明顯比非連作地占比高。

表1 辣椒盛花期根際土壤化學(xué)成分分析

注：“—”表示未檢測(cè)出。下表同。

表2 辣椒盛果期根際土壤化學(xué)成分分析

續(xù)表2

表3 辣椒盛花期根系化學(xué)成分分析

續(xù)表3

由表4可知，盛果期根系浸提液共檢測(cè)出11類共63種物質(zhì)，其中酯類8種、酸類20種、酚類5種、醇類11種、酮類6種、醛類6種、酰胺類2種、其他類5種，總體比7月盛花期數(shù)量相對(duì)減少，但同樣以酸類最多，占31.75%，醇類次之，占17.46%。棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸在幾個(gè)品種中的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。在黔椒5號(hào)、辣研2號(hào)、綏陽(yáng)小米辣非連作及連作地根系中，酚類、酯類總相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)連作地比非連作地高。酸類組分在綏陽(yáng)小米辣和黔椒5號(hào)根系中呈連作地高于非連作地趨勢(shì)。酰胺類物質(zhì)只有硬脂酸酰胺和油酸酰胺2種，且占比不是很高。水楊酸甲酯[18-20]、棕櫚酸甲酯[6，14，21-22]、硬脂酸甲酯[6]、苯甲酸[14-15]、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸[6]、硬脂酸[23-27]、香草酸[6]、花生酸[27]、苯甲醇[14]、葉綠醇[15，22]、苯甲醛[28]、香草醛[4-5，15]已在煙草等作物上被報(bào)道具有化感作用，它們?cè)诒狙芯恐幸脖粰z出，但是被檢相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小。

表4 辣椒盛果期根系化學(xué)成分分析

續(xù)表4

3 結(jié)論與討論

從本研究可以看出，辣椒盛花期及盛果期根系及根際土壤的化學(xué)成分?jǐn)?shù)目、種類及相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體呈動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，如醇類物質(zhì)是辣椒根系及土壤中檢測(cè)到的所有物質(zhì)中占比較高的一類組分，不同時(shí)期均檢測(cè)出10種以上物質(zhì)；烷類物質(zhì)只在7月的連作土壤里檢出；酯類組分?jǐn)?shù)目隨著生育期的推移，在土壤中呈小范圍上升趨勢(shì)；酮類成分在盛花期和盛果期的根際土壤中都被鑒定出4種有效組分，比辣椒根系的含量少2～3種；醛類物質(zhì)隨著生育期的推后，在土壤中數(shù)量增多，在根系中減少。植株根系通過(guò)與土壤進(jìn)行物質(zhì)交換，通過(guò)乙酸途徑合成化感物質(zhì)，根部酸性增加，土壤微生物在根部積累，自毒物質(zhì)降低了植株生長(zhǎng)能力和抵抗力，與多年累積的病原菌共同作用，形成嚴(yán)重的土傳病害，是連作障礙產(chǎn)生的重要原因[29]，關(guān)于其物質(zhì)交換代謝機(jī)制及途徑有待深入研究。

不同辣椒品種、生育期及種植年限對(duì)辣椒根系及土壤化學(xué)成分的影響不同，主要是由于在辣椒生長(zhǎng)階段根系會(huì)向土壤中分泌大量的根系分泌物，而有機(jī)酸是分泌物的主要成分，長(zhǎng)期連作后，根系分泌物會(huì)在土壤中不斷積累[30]。如本研究中酚、酸類物質(zhì)在7月即辣椒盛花期時(shí)，根系里共檢測(cè)出26種物質(zhì)(其中許多物質(zhì)是已被證實(shí)為具有化感作用的物質(zhì))，土壤中檢出2種；但通過(guò)1個(gè)生育期的積累即到辣椒盛果期時(shí)，根際土壤中酚、酸類物質(zhì)的數(shù)目迅速提高到10種，根系的數(shù)目?jī)H比之前減少1種，這種積累趨勢(shì)與諸多文獻(xiàn)報(bào)道一致。并且研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)仄贩N綏陽(yáng)小米辣連作地根際土壤中的酚、酸類物質(zhì)數(shù)目增長(zhǎng)速度最快，從最初的1種物質(zhì)增長(zhǎng)到10種，其酸類組分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高45.78百分點(diǎn)，明顯高于其非連作地和其他品種的處理，且根系中酚、酸類物質(zhì)的初始相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)比雜交品種黔椒5號(hào)(線椒)和辣研2號(hào)(朝天椒)平均數(shù)要高。相比之下，黔椒5號(hào)和辣研2號(hào)雖然在根系檢測(cè)出的酚、酸類物質(zhì)也比較多，但在其連作地及非連作地土壤里的檢出量少且相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低。本研究可能從另外一個(gè)方向說(shuō)明了生產(chǎn)中雜交種比本地自留種種植優(yōu)勢(shì)強(qiáng)的一個(gè)原因，另外也驗(yàn)證了根系分泌物和土壤化學(xué)成分隨著連作年限增加的變化規(guī)律，如馬云華等就黃瓜連作的研究表明，隨著連作年限的增加，土壤中酚酸類物質(zhì)明顯積累[31]。本研究未能在土壤中檢測(cè)到與須文報(bào)道的主要化感物質(zhì)為烷類、酯類等相似的化學(xué)成分，可能與連作時(shí)間長(zhǎng)短、品種有關(guān)或者存在地區(qū)差異[32]。

現(xiàn)已有大量研究證實(shí)酚酸類物質(zhì)的積累會(huì)加劇作物土傳病害發(fā)生等連作障礙，如隨酚酸類物質(zhì)處理濃度的升高，土壤尖孢鐮刀菌和甜瓜疫霉菌數(shù)量呈持續(xù)上升趨勢(shì)，導(dǎo)致黃瓜枯萎病發(fā)生[31]。茄子根系分泌物中自毒物質(zhì)香草醛和肉桂酸助長(zhǎng)了茄子黃萎病的發(fā)生[33]。苯甲酸和肉桂酸處理可顯著提高西瓜幼苗枯萎病的發(fā)病率，隨著苯甲酸和肉桂酸處理濃度的提高，西瓜枯萎病病情指數(shù)和死苗率逐漸上升[34]。近年來(lái)，隨著辣椒經(jīng)濟(jì)價(jià)值的日益增長(zhǎng)，辣椒產(chǎn)業(yè)規(guī)?；l(fā)展，貴州地區(qū)因地理?xiàng)l件有限，辣椒連作已呈現(xiàn)不可阻擋的趨勢(shì)，然而連作障礙對(duì)作物品質(zhì)及產(chǎn)量造成了不可估量的損害。本研究大致明確了當(dāng)?shù)仄贩N綏陽(yáng)小米辣以及雜交品種黔椒5號(hào)、辣研2號(hào)盛花期及盛果期植株根系及根際土壤化學(xué)成分，結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的化感物質(zhì)種類，解析了連作與非連作過(guò)程中酚酸類化感物質(zhì)的積累規(guī)律，可對(duì)指導(dǎo)地方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供一定的理論支撐，對(duì)科學(xué)解決辣椒連作障礙有長(zhǎng)遠(yuǎn)意義，但是化感物質(zhì)與品種的關(guān)系、不同活動(dòng)時(shí)期變化規(guī)律、與微生物的關(guān)系、與環(huán)境的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。