丁 鴿， 張代臻， 丁小余， 蔡照勝， 商士斌

(1.鹽城工學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，江蘇鹽城 224003； 2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210046； 3.江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)建設(shè)實驗室，江蘇鹽城 224002； 4.中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，江蘇南京 210042)

石斛是我國蘭科石斛屬(Dendrobium)的珍稀瀕危物種，主要分布于我國植物區(qū)系學(xué)上的熱點(diǎn)地區(qū)“嶺南地區(qū)”和“華中地區(qū)”[1]，長于海拔800～1 600 m的懸崖巖石或樹干上。石斛屬為蘭科第2大屬，在我國共有74種和2個變種[2]。獨(dú)特的生境造就了石斛藥材的非凡品質(zhì)，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中石斛藥材就被列為上品，應(yīng)用歷史悠久，具有養(yǎng)陰生津、潤肺明目、抗癌防老等功效[3]。金釵石斛是《中華人民共和國藥典》(2005版)[4]收錄的適合加工成藥材的5種石斛之一，由于相似的外形及組織結(jié)構(gòu)，其他許多同屬植物及金石斛屬、石仙桃屬的植物在加工后被用于冒充石斛正品在市場出售[5-6]。準(zhǔn)確鑒定石斛種類是保證藥材質(zhì)量和藥理活性研究的重要前提，對于瀕危物種的資源保護(hù)也具有重要意義。

nad1基因編碼線粒體呼吸傳遞鏈的復(fù)合體Ⅰ-泛醌氧化還原酶(也可稱NADH脫氫酶)的nad1亞基，是1個結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定的線粒體基因，由5個外顯子構(gòu)成[7]，依次是nad1/a～nad1/e。nad1基因的內(nèi)含子2序列位于nad1/b和nad1/c之間，可能與mRNA成熟的反式剪接機(jī)制有關(guān)。植物線粒體中許多基因存在進(jìn)化較快的內(nèi)含子，加上被子植物線粒體是母系遺傳，因此線粒體DNA片段信息同樣提供了重要的進(jìn)化信息，在植物系統(tǒng)發(fā)育重建、居群生物學(xué)和生物地理學(xué)研究中有許多成功的報道[2，8-9]。SNP(single nucleotide polymorphism)稱為單核苷酸多態(tài)性，是指在染色體基因組水平上由單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入及缺失等形式[10]。SNP具有位點(diǎn)豐富、更高的遺傳穩(wěn)定性、易實現(xiàn)分析的自動化等特點(diǎn)[11-12]，廣泛地應(yīng)用于疾病檢測、分子育種及中藥材鑒別等領(lǐng)域[13-15]。

AS-PCR，即位點(diǎn)特異性PCR，首次利用是DeSalle等在Nature上發(fā)表的對魚子醬中魚卵所屬鱘魚的種類進(jìn)行鑒別[16]。在中藥材鑒定領(lǐng)域，有姜黃、大黃、齒瓣石斛、鐵皮石斛等的位點(diǎn)特異性鑒別研究[17-20]。DNA序列分析是常用于植物分子系統(tǒng)學(xué)研究的一類重要的分子標(biāo)記，它是通過比較DNA序列的差異來反映生物體在遺傳上的差異，在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來DNA barcoding(DNA條形碼)技術(shù)，被越來越多地應(yīng)用于中藥材鑒定的研究中。DNA條形碼是基于DNA片段來表征生物物種身份并且有足夠變異位點(diǎn)同時容易擴(kuò)增的技術(shù)[2，21]，已經(jīng)在人參、金銀花、石斛等中藥材基原植物的鑒定中得到廣泛應(yīng)用[22-25]。本研究擬對金釵石斛及其近緣物種的nad1基因內(nèi)含子2序列進(jìn)行研究，確定該序列作為DNA條形碼的可行性并尋找SNP分子標(biāo)記，研究基因片段在植物鑒定方面的應(yīng)用并探討金釵石斛的進(jìn)化地位，為瀕危物種的保護(hù)生物學(xué)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用材料主要采自云南、廣西、廣東等地，各種植物的種類、來源及GenBank登錄號詳見表1。

1.2 基因組DNA提取

取硅膠干燥的材料葉片0.1 g，用無菌水沖洗干凈，采用改良十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[26]提取葉片總DNA。利用紫外分光光度計測定所提取的DNA模板質(zhì)量，評價其DNA濃度及純度，于-20 ℃保存。

表1 供試材料來源及登錄號

1.3 引物設(shè)計及PCR擴(kuò)增

引物根據(jù)Zhang等對石斛屬植物的研究[27]設(shè)計，序列如下：nad1 F，5′- GCATTACGATCTGCAGCTCA-3′；nad1 R，5 ′-GGAGCTCGATTAGTTTCTGC-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在 30 μL 的反應(yīng)體系中進(jìn)行，包括10 mmol/L Tris-HCl(pH值為8.3)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，1 UTaq酶，200 mmol/L dNTPs，各10 pmol/L 引物，DNA模板約80 ng。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.4 PCR產(chǎn)物純化與測序

PCR產(chǎn)物用美國Axygen試劑盒純化，純化產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 DNA序列分析

所得石斛屬植物的序列用Clustal X 1.8軟件完成比對，用Mega 5.0軟件分析堿基組成、變異位點(diǎn)數(shù)、簡約信息位點(diǎn)數(shù)、轉(zhuǎn)換和顛換數(shù)。以Kimura-2參數(shù)計算遺傳距離，以牛齒蘭(Appendiculacornuta)為外類群，分析植物的種間變異，構(gòu)建UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean，非加權(quán)組平均法)系統(tǒng)發(fā)生樹，分析石斛屬各物種的親緣關(guān)系。

1.6 位點(diǎn)特異性引物設(shè)計及擴(kuò)增

運(yùn)用Clustal X1.8、Mega 5.0軟件對所得序列進(jìn)行排列，根據(jù)堿基位點(diǎn)的變異設(shè)計特異性引物，對金釵石斛及其混淆品進(jìn)行鑒別。擴(kuò)增反應(yīng)的引物序列如下：JCF，5′-CTAAACGA-CGAGCAAACACT-3′；JCR，5′-AATTTCTG-CGCCCTAAGAAGC-3′。30 μL的反應(yīng)體系包括3 μL 10×PCR buffer，2 μL 25 mmol/L MgCl2，2 μL 2 mmol/L dNTPs，1 UTaq酶 ，1 μL 10 pmol/L 引物，100 ng DNA模板。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1.5 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 nad1 intron 2序列的長度和變異

金釵石斛及其近緣物種(不含外類群)的nad1intron2序列長度為774～852 bp，長度變異較大，其中金釵石斛的nad1內(nèi)含子2序列長度為843 bp。經(jīng)Clustal X 1.8和MEGA 5.0軟件排序，簡并序列長度為871 bp。其中堿基組成平均含量T為18.2%、C為25.6%、A為25.8%、G為30.4%，GC含量為56%，GC含量明顯高于AT含量，其中金釵石斛GC含量為55.8%，各樣本的序列長度及堿基含量見表2。

表2 金釵石斛及混淆品nad1 intron 2序列長度及堿基組成

15種石斛有保守位點(diǎn)817個，變異位點(diǎn)27個，簡約信息位點(diǎn)5個，單變異位點(diǎn)22個。共有6處indels(堿基缺失)，其中較長的indels位于349～417、579～596 bp，不同的物種表現(xiàn)出缺失堿基的長度和位置的差異；較短的indels位于 140～146、445～451、522～528、610～613 bp，最大的長6 bp，最小的長4 bp。

2.2 基于SNP的金釵石斛的鑒別

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，簡稱SNP)，主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。金釵石斛與其混淆品之間存在22個SNP位點(diǎn)，可以用于物種之間的鑒別。在獲得的15種石斛的nad1intron2序列中，金釵石斛在第603位上的堿基為T，其他種類均為C，該位點(diǎn)可以作為金釵石斛與其混淆品的種間鑒別的有效位點(diǎn)。根據(jù)特異性位點(diǎn)設(shè)計的引物用于石斛植物的擴(kuò)增，結(jié)果顯示，只有在金釵石斛中產(chǎn)生了大約400 bp長度的單一條帶，說明該變異性引物用于物種鑒定的可行性。

2.3 遺傳距離的計算及基于DNA barcoding的石斛屬親緣關(guān)系分析

應(yīng)用MEGA 5.0進(jìn)行序列分析，以Kimura-2參數(shù)計算各物種之間的遺傳距離，結(jié)果見表3。從遺傳距離來看，鐵皮石斛與黃花石斛遺傳距離差異最小，為0，而兜唇石斛與齒瓣石斛的差異最大，為0.010，平均遺傳距離為0.004。外類群牛齒蘭與15種石斛的遺傳距離為0.147～0.156。利用MEGA 5.0軟件對獲得的序列片段進(jìn)行分析，構(gòu)建序列進(jìn)化UPGMA樹(圖1)。UPGMA樹分析發(fā)現(xiàn)，矮石斛、報春石斛、黃花石斛、鐵皮石斛首先聚為1支，然后與玫瑰石斛、粉花石斛、細(xì)葉石斛、流蘇石斛、束花石斛形成的分支聚為1支，最后與晶帽石斛、球花石斛、金釵石斛、兜唇石斛、齒瓣石斛依次聚類，形成與牛齒蘭并列的2個大支?？梢钥闯?，nad1intron2序列可以對石斛種類進(jìn)行有效的鑒別，適宜作為分子條形碼用于金釵石斛及其近緣物種的親緣關(guān)系分析。

表3 基于nad1 intron 2序列的石斛屬及牛齒蘭遺傳距離分析

注：物種編號同表1。

3 討論與結(jié)論

DNA是植物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，具有穩(wěn)定、可靠、不受外界影響和可遺傳性等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥用植物鑒別、植物分類及進(jìn)化關(guān)系分析的依據(jù)[28-32]。線粒體基因含有較好的位點(diǎn)多樣性水平，基因重排對于近緣物種的鑒定具有較大的意義，在動物中廣泛應(yīng)用于譜系地理、系統(tǒng)發(fā)育、DNA條形碼鑒定等研究[33-34]。而植物線粒體基因組遠(yuǎn)大于動物線粒體基因組，變異幅度可能高達(dá)10倍以上，在同一科中也可能存在較大差異[35-36]。nad1intron2序列用于藥用植物的鑒別并有效地追溯其原產(chǎn)地[2，27]、稻族的系統(tǒng)發(fā)育及分析鑒定[37]、挪威云杉不同居群的遺傳關(guān)系分析[38]等研究，均取得了較好的效果。本試驗通過對15種石斛的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體基因nad1intron2變異位點(diǎn)數(shù)量為27個，可用于金釵石斛及其混淆品的鑒別。

與其他分子標(biāo)記相比，SNP具有位點(diǎn)豐富、檢驗成本低、更高的穩(wěn)定性及檢出率高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物遺傳育種、物種鑒別及中藥材的鑒定研究中[15，39]。位點(diǎn)特異性鑒別PCR(allele-specific diagnostic polymerasechain reaction，簡稱AS-PCR)具有操作簡單、高效等特點(diǎn)，亦被廣泛應(yīng)用于藥材及其混淆品、偽品的鑒別[6，15]。而線粒體基因序列中含有的SNP位點(diǎn)，方便結(jié)合AS-PCR等技術(shù)，更利于物種的鑒定。本研究中，存在于603位的SNP位點(diǎn)，可以成功地鑒別金釵石斛與其混淆品，為石斛屬植物的鑒別及其他中藥材的物種鑒定及規(guī)范中藥材市場提供理論依據(jù)。

DNA barcoding是2003年由加拿大圭爾夫大學(xué)的Paul Hebert正式提出的，是利用1段短的、標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段，從基因組標(biāo)準(zhǔn)化區(qū)間對物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定[40]。DNA條形碼的優(yōu)點(diǎn)包括不受樣品形態(tài)和發(fā)育階段限制、準(zhǔn)確性高等，可以從分子層面構(gòu)建物種的序列庫并快速有效地進(jìn)行鑒別，可以促進(jìn)物種的鑒定分類及保護(hù)生物學(xué)的發(fā)展，對新物種的發(fā)現(xiàn)和珍稀瀕危物種的保護(hù)具有重要的意義。本研究利用的基于線粒體nad1intron2序列的DNA條形碼技術(shù)，排除了植物形態(tài)等條件的限制，可以直接從分子水平對金釵石斛及其近緣物種進(jìn)行鑒別，效果較好。研究過程中涉及的物種序列的GC含量、遺傳距離、UPGMA進(jìn)化樹等結(jié)果，可為石斛的市場應(yīng)用提供有效的鑒別方法，為石斛類藥材的鑒定提供了一種新的思路，也為找到更適合的藥用植物DNA條形碼，從而構(gòu)建更完整的公共序列數(shù)據(jù)庫奠定基礎(chǔ)。