王惠君， 孫 妍， 王文泉， 范慶君， 王仕明， 謝詩宏

(1.海南農(nóng)墾南繁種業(yè)有限公司，海南三亞 572000； 2.海南熱帶海洋學(xué)院，海南三亞 572022； 3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？?571101)

目前，對海洋生物遺傳育種工作[1]的研究剛剛起步，其研究的深度遠(yuǎn)落后于陸地生物[2]的研究。雖然近20年來海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展較為迅速，但其種類的選擇僅僅停留在少數(shù)幾種經(jīng)濟(jì)型海洋生物上[3-4]，養(yǎng)殖方法也處于野生或半野生的狀態(tài)，這嚴(yán)重制約了海洋生物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展?？焖儆行У赝诰蚝Ｑ笊镔Y源的潛力，對經(jīng)濟(jì)型海洋生物優(yōu)勢種的選育工作意義重大，研究內(nèi)容具體包括合適生長周期的選育種、生長快肉質(zhì)好的選育種、抗逆性強(qiáng)的選育種、藥用型生物的選育種等。

遺傳和變異作為生物的重要特征，決定著海洋生物的進(jìn)化。遺傳標(biāo)記是研究海洋生物遺傳和變異的基本手段和方法。作為能穩(wěn)定遺傳、表達(dá)海洋生物變異性的這類可以被檢測形狀或物質(zhì)的遺傳標(biāo)記，前后主要經(jīng)歷了形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記、DNA分子標(biāo)記等4個發(fā)展階段。作為理想的標(biāo)記有如下特性：標(biāo)記遍布整個基因組并在整個基因組中的分布要均勻，多態(tài)性較高，共顯性遺傳，受外界環(huán)境影響較小，檢測簡單、快速、重復(fù)性好、成本低廉等。在具體的試驗(yàn)過程中現(xiàn)有遺傳標(biāo)記技術(shù)要想達(dá)到理想狀態(tài)仍須改進(jìn)。DNA分子標(biāo)記技術(shù)與形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記相比具有多態(tài)性較高、標(biāo)記數(shù)量多、不受發(fā)育階段和環(huán)境條件的影響等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用在DNA指紋圖譜的構(gòu)建、生物遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定、生物進(jìn)化、基因定位、基因克隆、基因組遺傳圖譜的構(gòu)建、標(biāo)記輔助選擇等方面。筆者依據(jù)對海洋生物基因組信息量掌握的多少，分別主要介紹分子標(biāo)記的原理、優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用范圍，以期為海洋生物遺傳育種的相關(guān)研究工作提供有價值的參考。

1 海洋生物基因組信息未知的情況下對分子標(biāo)記技術(shù)方法的選擇

在海洋生物基因組未知的情況下，應(yīng)用標(biāo)記技術(shù)對基因組進(jìn)行探索，從難易程度和效率上綜合考慮選擇如下：擴(kuò)增子長度多態(tài)性(amplicon length polymorphism，簡稱ALP)、內(nèi)部簡單重復(fù)序列(inter simple sequence repeats，簡稱ISSR)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，簡稱SRAP)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP)、多樣性芯片技術(shù)( diversity arrays technology，簡稱DArT)。

1.1 擴(kuò)增子長度多態(tài)性

ALP是以隨機(jī)引物PCR技術(shù)擴(kuò)增為基礎(chǔ)的一類標(biāo)記合稱，它主要包括的分子標(biāo)記有DNA擴(kuò)增指紋印記(DNA amplified figerpriting，簡稱DAF)、隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增(arbitrarily primed polymerase chain reaction，簡稱AP-PCR)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD)。其中，AP-PCR技術(shù)[5]和RAPD技術(shù)[6]是由Welsh等于1990年提出的，DAF是一種改進(jìn)的RAPD分析技術(shù)。三者都是利用PCR技術(shù)為基礎(chǔ)來檢測DNA多態(tài)性的方法?；驹恚篋AF使用的是高濃度短引物(5～8 bp)、RAPD使用隨機(jī)短引物(8～10 bp)、AP-PCR使用的引物長度范圍為 10～50 bp，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到非定點(diǎn)擴(kuò)增DNA片段，只要基因組在擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)DNA片段上發(fā)生堿基突變、缺失或插入就有可能導(dǎo)致該區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生改變，擴(kuò)增出的DNA片段大小和數(shù)量隨即會發(fā)生變化。利用凝膠電泳分析該DNA片段，然后用銀染法進(jìn)行顯色讀帶，將使擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)不同或相同的多態(tài)性DNA片段。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)簡單且成本低、DNA用量少、對基因組檢測速度快、具有通用性。該技術(shù)的缺點(diǎn)是不能鑒別純合子和雜合子、穩(wěn)定性和重復(fù)性較差。其中，DAF技術(shù)使用高濃度的短引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的DNA片段在凝膠上分離后通過銀染染色形成的譜帶過于復(fù)雜。由于ALP技術(shù)簡單、容易操作、可高效探索未知基因組多態(tài)性檢測等特性，使該技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。在海洋生物研究中，RAPD技術(shù)可以應(yīng)用在種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析、功能基因的探索等領(lǐng)域[7-8]，RAPD技術(shù)與構(gòu)建DNA混合近等基因池分離分析方法(bulked segregant analysis，簡稱BSA)相結(jié)合更有利于基因定位、遺傳圖譜的飽和分析等研究。AP-PCR和DAF技術(shù)則分別用于基因組指紋分析、遺傳圖譜的構(gòu)建。ALP技術(shù)主要應(yīng)用在大黃魚、馬氏珠母貝、翡翠貽貝、櫛孔扇貝、青蛤、文蛤、泥蚶等海洋生物物種上。

1.2 內(nèi)部簡單重復(fù)序列

內(nèi)部簡單重復(fù)序列又稱為錨定簡單重復(fù)序列(anchored simple sequence reapeats，簡稱ASSR)，該標(biāo)記是依據(jù)真核生物中SSR的分布較為普遍，且進(jìn)化速度較快的特性，檢測出基因組中較多的多態(tài)性位點(diǎn)。ISSR標(biāo)記利用常出現(xiàn)的SSR本身作為錨定引物(在SSR序列的3′端或5′端加入2～4個隨機(jī)堿基)，再配1個隨機(jī)引物進(jìn)行組合之后進(jìn)行擴(kuò)增，因具有無須克隆和測序的特性。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)為DNA用量較少、成本低、技術(shù)門檻不高、穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，多態(tài)性表現(xiàn)為中等。該技術(shù)的缺點(diǎn)為有些物種的ISSR標(biāo)記可能較少，不能推廣到所有物種。該技術(shù)可以應(yīng)用在對海洋生物的生物遺傳多樣性分析[9-12]等研究中。

1.3 序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性

SRAP又稱為基于序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence based amplified polymorphism，簡稱SBAP)，由美國加州大學(xué)Li等提出，其原理是依據(jù)基因外顯子中鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)含量豐富而內(nèi)含子、啟動子中腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)含量豐富的特點(diǎn)設(shè)計2套不同的引物進(jìn)行擴(kuò)增[13]。在基因組中主要檢測對象為開放讀碼框(open reading frame，簡稱ORF)區(qū)域。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)為成本低、技術(shù)簡單、試驗(yàn)穩(wěn)定、多態(tài)性中等。該技術(shù)的缺點(diǎn)為該標(biāo)記的設(shè)計在對著絲粒和端粒附近基因組區(qū)域?qū)儆诿^(qū)，且并非對所有生物具有通用性，仍須針對不同的生物進(jìn)行開發(fā)。該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在對物種質(zhì)資源多態(tài)性評價[14]、遺傳圖譜的構(gòu)建以及基因定位等方面。

1.4 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性

AFLP又被稱為選擇性限制片段擴(kuò)增(selective restrictive fragment amplification，簡稱SRFA)，是由荷蘭科學(xué)家Zabeau等發(fā)現(xiàn)一種分析基因組DNA多態(tài)性的方法[15]。它以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合擴(kuò)增片段的多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP)和RAPD 2種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。首先用1對限制性內(nèi)切酶把基因組DNA進(jìn)行雙酶切，接著對酶切片段的兩端用連接酶增加上帶有特定堿基序列的“接頭”，然后用選擇性引物對酶切片段進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增，通過聚丙烯酰胺測序膠進(jìn)行電泳，將特異的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物片段分離開，然后用熒光法、放射性法、銀染法等進(jìn)行檢測，最后用生物分析軟件對DNA譜帶進(jìn)行分析。該技術(shù)發(fā)展較快，同時有些學(xué)者在研究過程中根據(jù)試驗(yàn)的內(nèi)容進(jìn)行了改進(jìn)。在原有雙酶切法基礎(chǔ)上增加了單限制性內(nèi)切酶選擇擴(kuò)增片段技術(shù)和三限制性內(nèi)切酶選擇擴(kuò)增性擴(kuò)增片段技術(shù)，借助以上2種方法對AFLP技術(shù)進(jìn)行了完善。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)集RFLP和RAPD技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)于一身，具有高通用性、高多態(tài)性、高穩(wěn)定性、高分辨率、高效性等特點(diǎn)。該技術(shù)的缺點(diǎn)為所需樣品DNA質(zhì)量高、試驗(yàn)成本較高、步驟復(fù)雜且操作要求嚴(yán)格等。AFLP技術(shù)應(yīng)用到海洋生物的種類包括鮸魚、金鯛、大黃魚、石斑魚、斑馬魚、舌齒鱸、紫菜、翅藻等，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用在生物遺傳多樣性分析基因的表達(dá)與調(diào)控研究[16-19]、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和種質(zhì)鑒定等研究領(lǐng)域。

1.5 多樣性芯片技術(shù)

2001年，Jaccoud等在酶切連接技術(shù)、芯片雜交技術(shù)等基礎(chǔ)上研發(fā)了一項辨別不同基因組之間多態(tài)性的方法，即多樣性芯片技術(shù)[20]。該方法對不同樣本的基因組DNA等量混合并進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化后，及時將酶切片段與接頭連接，隨后用與接頭對應(yīng)的特異性引物對該基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到該基因組的代表性片段。將該片段用不同的熒光進(jìn)行標(biāo)記后作為探針再與芯片進(jìn)行雜交。利用掃描儀檢測雜交信號的有無或強(qiáng)弱來確定待檢測樣本的遺傳差別，這些差別的標(biāo)記就是DArT標(biāo)記。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)為試驗(yàn)重復(fù)性好、信息穩(wěn)定可靠、高通量信息可實(shí)現(xiàn)自動化分析、可用于沒有序列信息的任何海洋類物種、新的標(biāo)記發(fā)現(xiàn)和標(biāo)記評價都是在同一芯片上同時進(jìn)行的、不易受發(fā)育階段時空表達(dá)的影響。該技術(shù)的缺點(diǎn)為試驗(yàn)成本較高、不適合普通實(shí)驗(yàn)室、標(biāo)記為顯性、不能區(qū)分純/雜合型。該技術(shù)可以應(yīng)用于遺傳分類及進(jìn)化的分析[21]、遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、輔助育種[22]等研究領(lǐng)域。

2 掌握較少海洋生物基因組信息情況下分子標(biāo)記技術(shù)方法的選擇

在已知較少海洋生物基因組信息的情況下，用標(biāo)記技術(shù)方法對基因組進(jìn)行探索，從難易程度和效率上綜合考慮選擇排序如下：(1)以重復(fù)序列為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，包含簡單序列重復(fù)(simple sequence repeat，簡稱SSR)、數(shù)目串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(variable number of tandem repeat，簡稱VNTR)、單引物擴(kuò)增反應(yīng)(single primer amplification reaction，簡稱SPAR)、小衛(wèi)星區(qū)域DNA直接擴(kuò)增(directed amplification of minisatellite region，簡稱DAMD)等；(2)序列特征化擴(kuò)增區(qū)域(sequence characterized amplified region，簡稱SCAR)；(3)靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性(target region amplified polymorphism，簡稱TRAP)；(4)以mRNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，包含表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed seque tags，簡稱ESTs)、逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，簡稱RT-PCR)、差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR(different display reverse transcript PCR，簡稱DDRT-PCR)、特征性差異分析(representive difference analysis，簡稱RAD)；(5)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequence tagged site，簡稱STS)；(6)線粒體DNA(mitochondrial DNA，簡稱mtDNA)標(biāo)記；(7)擴(kuò)增的片段多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP)；(8)染色體原位雜交(chromosome in situ hybridization，簡稱CISH)。

2.1 以重復(fù)序列為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)

該系列的分子標(biāo)記技術(shù)包括SSR、VNTR、SPAR、DAMD等。其主要依據(jù)為在真核生物普遍存在的遍布整個基因組的排列為2～5 bp或10～1 000 bp不等的重復(fù)序列，稱之為衛(wèi)星。2～5 bp較短串聯(lián)重復(fù)序列稱之為微衛(wèi)星，其中(CA)n重復(fù)序列較為普遍。SSR[又稱微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)]和VNTR[又稱小衛(wèi)星DNA(mini satellite DNA)]的引物是依據(jù)重復(fù)序列兩翼特異保守序列進(jìn)行設(shè)計的，擴(kuò)增出片段的多態(tài)性即為衛(wèi)星的多態(tài)性。SPAR技術(shù)又稱為微衛(wèi)星引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(microsatellite-primed PCR，簡稱MP-PCR)，與RAPD相類似，常用1個引物，在SPAR分子標(biāo)記技術(shù)中不同的是所用引物不是隨機(jī)的而是在SSR標(biāo)記基礎(chǔ)上開發(fā)設(shè)計的，擴(kuò)增出的片段是SSR之間的DNA序列。DAMD標(biāo)記技術(shù)直接以小衛(wèi)星的核心序列為引物對基因組進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增。該類標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)為試驗(yàn)技術(shù)成熟且易操作、檢測穩(wěn)定且快速、信息量較大、分辨率較高、多態(tài)性中、為顯性標(biāo)記。但也存在缺點(diǎn)，前期研發(fā)的成本高，每個物種須要針對性開發(fā)引物因而不具有通用性。在科學(xué)研究中通常以SSR標(biāo)記作為首選。該類標(biāo)記已成為種群研究和生物進(jìn)化領(lǐng)域首選的分子標(biāo)記之一，廣泛應(yīng)用于種群生物遺傳多樣性分析[23]、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、生物雜交育種分析和系統(tǒng)發(fā)生等領(lǐng)域。

2.2 序列特征化擴(kuò)增區(qū)域

SCAR技術(shù)是在綜合了RAPD和SSR優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。為了提高RAPD標(biāo)記的穩(wěn)定性，對基因組DNA分析之后再對目標(biāo)RAPD片段進(jìn)行克隆分析，在該片段末端采取類似SSR引物兩翼序列進(jìn)行測序，設(shè)計特定引物，最后再對基因組DNA進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，這樣使得該片段與原RAPD片段相比穩(wěn)定性和專一性更強(qiáng)。該標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)為穩(wěn)定性好、為共顯性遺傳；該標(biāo)的記缺點(diǎn)是操作相對復(fù)雜、須要測序、成本比ISSR和SRAP標(biāo)記略高。該標(biāo)記可應(yīng)用于基因定位和作圖[24]等研究領(lǐng)域。

2.3 以mRNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記

該系列的分子標(biāo)記技術(shù)主要包括EST、RT-PCR、DDRT-PCR、cDNA-AFLP、cDNA-RFLP等。該類分子標(biāo)記都是在構(gòu)建cDNA文庫基礎(chǔ)上進(jìn)行研究的，其中表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed seque tags，簡稱EST)是從cDNA文庫中隨機(jī)挑選克隆，然后對該序列進(jìn)行測序從而獲得長度為300～500 bp的短cDNA序列，以此為基礎(chǔ)開發(fā)出來的引物標(biāo)記技術(shù)稱之為EST標(biāo)記，EST標(biāo)記分別與SSR、AFLP、RFLP、核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，簡稱SNP)等相結(jié)合開發(fā)出EST-SSR[25-26]、EST-AFLP、EST-RFLP、EST-SNP[27]等標(biāo)記方法。RT-PCR、DDRT-PCR、cDNA-AFLP、cDNA-RFLP等標(biāo)記主要是研究mRNA基因差異表達(dá)的多態(tài)性分析。該類技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)為除了cDNA-AFLP和cDNA-RFLP 2類技術(shù)外其他技術(shù)都相對簡單、操作方便，該類技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)研究的各個領(lǐng)域。該技術(shù)的缺點(diǎn)為EST測序方法存在誤差、匹配的應(yīng)用軟件存在局限性、揭示的基因信息不全、cDNA文庫的質(zhì)量要求異常嚴(yán)格、檢測到低豐度表達(dá)的基因較為困難、中豐度和高豐度表達(dá)的基因EST存在冗余性。

2.4 靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性

TRAP技術(shù)是由Hu等開發(fā)的，其原理是以EST信息庫和生物信息工具信息等數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，用目標(biāo)候選基因區(qū)域的DNA片段分析其該區(qū)域的多態(tài)性[28]。該技術(shù)采用2條約 18 bp 的引物，一條是依據(jù)EST數(shù)據(jù)庫設(shè)計的固定引物，另一條是針對外顯子和內(nèi)含子的特點(diǎn)設(shè)計的隨機(jī)引物。該技術(shù)通過對靶位區(qū)域進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，圍繞目標(biāo)候選基因序列產(chǎn)生多態(tài)性標(biāo)記。該標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)為高通量、高效率、易操作。該標(biāo)記的缺點(diǎn)為必須以EST和生物信息大數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，不能遍布整個基因組，只能針對特定的基因區(qū)域發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。

2.5 序列標(biāo)簽位點(diǎn)

序列標(biāo)簽位點(diǎn)是通過一段特定引物序列所界定的一類能夠在生物基因組中作為“路標(biāo)”使用的DNA標(biāo)記的統(tǒng)稱。該標(biāo)記必須滿足2個條件：序列已知、位置明確。該標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是可用于界定基因組的特異位點(diǎn)；該標(biāo)記的缺點(diǎn)是可利用的數(shù)量太少。該標(biāo)記作為遺傳圖譜與物理圖譜整合的共同位標(biāo)，隨著模式生物全基因組的測序開發(fā)，會發(fā)現(xiàn)更多的STS標(biāo)記。除此以外還有基因組概覽序列標(biāo)記(genome survey sequences，簡稱GSS)，主要來源于基因組序列。STS和GSS標(biāo)記是以mRNA為基礎(chǔ)的一類分子標(biāo)記的重要補(bǔ)充。

2.6 線粒體DNA標(biāo)記

線粒體DNA在細(xì)胞基因組中具有相對獨(dú)立性?；蚪MDNA可以通過母性遺傳，它不僅結(jié)構(gòu)簡單而且具有較高的專一性。大量生物的線粒體全基因組已被測序，發(fā)現(xiàn)其堿基序列和組成較為保守，利用其保守的特性開發(fā)出通用性較強(qiáng)的PCR反應(yīng)引物作為線粒體DNA標(biāo)記。該標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)為簡單快速；該標(biāo)記的缺點(diǎn)為作為一種核外遺傳物質(zhì)的mtDNA反映出的遺傳信息較為片面。近年來，mtDNA技術(shù)主要應(yīng)用于進(jìn)化遺傳學(xué)領(lǐng)域，該技術(shù)已成為研究真核生物發(fā)育生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、分子系統(tǒng)進(jìn)化[29]的一類重要模式體系。用該技術(shù)可檢測自然界的雜交漸滲現(xiàn)象，如海洋生物中的北美太陽魚等，還可用于追蹤特異物種的生活史，如追蹤大西洋鮭等。

2.7 擴(kuò)增的片段多態(tài)性

RFLP技術(shù)是用限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進(jìn)行酶切，根據(jù)其所產(chǎn)生的DNA分子片段的大小反映基因組DNA由于堿基的替換、缺失、重復(fù)、插入等導(dǎo)致限制性酶切位點(diǎn)改變的現(xiàn)象。該技術(shù)需要探針DNA標(biāo)記技術(shù)和Southern雜交技術(shù)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)為具有廣泛適用性、全基因組檢測、等位基因?yàn)楣诧@性；該技術(shù)的缺點(diǎn)為要求DNA的質(zhì)量較高、多態(tài)性偏低、試驗(yàn)操作繁瑣且因涉及放射性同位素的使用而不便、技術(shù)難度大且周期長、成本偏高。目前該技術(shù)已被應(yīng)用于基因突變分析、基因定位及診斷、親緣關(guān)系鑒定[30]、物種進(jìn)化及分類關(guān)系研究等方面，尤其在組建高密度遺傳圖譜[31]方面具有重要的實(shí)用價值。

2.8 染色體原位雜交

CISH是在Southern雜交的基礎(chǔ)上利用特異性核苷酸片段為探針與細(xì)胞基因組染色體DNA片段進(jìn)行雜交后直接在染色體上顯示特異DNA的方法。染色體原位雜交的優(yōu)點(diǎn)為精準(zhǔn)、直觀；缺點(diǎn)為涉及到同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記等技術(shù)，試驗(yàn)非常復(fù)雜。該技術(shù)主要應(yīng)用于物理圖譜的構(gòu)建。

3 掌握海洋生物基因組較多背景信息的情況下分子標(biāo)記技術(shù)方法的選擇

在掌握海洋生物基因組較多背景信息的情況下，對分子標(biāo)記技術(shù)方法存在2類選擇：一類是對海洋生物具體某等位基因多態(tài)性分析時所選的分子標(biāo)記技術(shù)；另一類是對海洋生物基因組信息的多態(tài)性進(jìn)行高通量分析時所選的分子標(biāo)記技術(shù)。

3.1 對海洋生物某個具體等位基因分析時選用的分子標(biāo)記技術(shù)

該類標(biāo)記技術(shù)主要有單鏈構(gòu)象多態(tài)(single- strand conformation poly-morphism，簡稱SSCP)和酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(cleaved amplified polymorphism sequences，簡稱CAPS)技術(shù)。2種技術(shù)的共同之處都是首先利用特定引物定點(diǎn)PCR擴(kuò)增基因組DNA中的特異序列片段。不同之處是SSCP把擴(kuò)增出的特異序列片段進(jìn)行變形處理，即雙鏈分開形成2條單鏈，然后通過非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳對片段進(jìn)行分離，最后染色并依據(jù)譜帶位置變化來判斷特異片段中是否存在突變；而CAPS技術(shù)是把擴(kuò)增出的特異序列片段使用1種限制性內(nèi)切酶及時進(jìn)行酶切，然后通過非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳對酶切片段進(jìn)行分離，最后染色并依據(jù)譜帶進(jìn)行RFLP分析。二者共同的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、結(jié)果可靠；其共同的缺點(diǎn)是只能針對基因組的某一特異序列片段進(jìn)行分析。其中SSCP技術(shù)與雜交雙鏈分析(heterocluplex analysis，簡稱Het)法結(jié)合可進(jìn)一步提高檢出率。該技術(shù)主要應(yīng)用于遺傳性疾病以及癌癥突變位點(diǎn)的檢測。而CAPS技術(shù)是PCR技術(shù)和RFLP技術(shù)相結(jié)合的一種檢測方法。CAPS技術(shù)揭示的是基因組特異性片段的限制性長度變異信息，是共顯性分子標(biāo)記，可以保持RFLP分析的精確度，可以分析基因組某一特異序列片段的多態(tài)性[32]。由于可供選的限制性內(nèi)切酶較多，因此該方法檢測到多態(tài)性的機(jī)會也較大。這2項技術(shù)是檢驗(yàn)SNP變異位點(diǎn)最簡便的方法。

3.2 高通量分析海洋生物基因組時選用的分子標(biāo)記技術(shù)

該類標(biāo)記技術(shù)是以mRNA轉(zhuǎn)錄本為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，其中以基因表達(dá)系列分析(serial analysis of gene expression，簡稱SAGE)作為代表；另一類是以開發(fā)核苷酸多態(tài)性的一類高通量分析技術(shù)，包括代表性寡核苷酸芯片分析(representational oligonu-cleotide microarray analysis，簡稱ROMA)、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)標(biāo)簽(restriction-site associated DNA，簡稱RAD)。

3.2.1 基因表達(dá)系列分析 1995年，美國學(xué)者Velculescu等提出了SAGE分子標(biāo)記技術(shù)[33]，該技術(shù)主要應(yīng)用于基因表達(dá)模式的分析。其原理是從一個轉(zhuǎn)錄本內(nèi)分離得到10～14 bp的短標(biāo)簽，將多個短標(biāo)簽連接并集中到一個克隆里面進(jìn)行測序，以連續(xù)的數(shù)據(jù)形式進(jìn)行軟件運(yùn)算處理，借助該模式可以對較多的mRNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行高通量運(yùn)算分析。該標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)為與EST、DDRT-PCR、RAD等技術(shù)相比具有更強(qiáng)的靈敏性，較容易檢測到低豐度表達(dá)的基因，可以在不須要知道基因組信息的情況下檢測出所有基因的表達(dá)情況[34]；該標(biāo)記的缺點(diǎn)為所得到的低豐度基因表達(dá)標(biāo)簽很難與網(wǎng)絡(luò)上現(xiàn)有Genbank等基因庫中的基因序列相互匹配。在該技術(shù)的基礎(chǔ)上又發(fā)展出了Long SAGE、3′ Long SAGE、5′ Long SAGE等技術(shù)，其與SAGE相比提高了基因標(biāo)簽的特異性，增強(qiáng)了標(biāo)簽的匹配率。2004年Trinklein等在 SAGE 基礎(chǔ)上又研發(fā)出使用配對末端雙標(biāo)簽進(jìn)行基因識別特征分析(gene-identification signature analysis using paired-end ditags，簡稱GIS-PET)技術(shù)[35]，該技術(shù)不僅可獲得完整全長基因的5′ 端和3′端標(biāo)簽，還可以通過PCR擴(kuò)增技術(shù)得到基因全序列。該技術(shù)應(yīng)用于染色體基因注釋的同時還可以應(yīng)用于構(gòu)建基因啟動子圖譜。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)為可定量、全面地對基因表達(dá)模式進(jìn)行分析、具有較高的標(biāo)簽特異性、可以擴(kuò)增新基因全長序列。該技術(shù)的缺點(diǎn)為通量上有缺陷，只能適合于對小規(guī)模樣品基因差異表達(dá)譜的分析，其通量遠(yuǎn)比不上其他高通量上分析的分子標(biāo)記，如微陣列技術(shù)等。

3.2.2 核苷酸多態(tài)性 1996年美國學(xué)者Lander等第1次提出了SNP標(biāo)記[36]，即第3代的DNA遺傳標(biāo)記。SNP是指同一特異性位點(diǎn)的不同等位基因之間的差異，其原理是由于單堿基顛倒、轉(zhuǎn)換、缺失、插入機(jī)制導(dǎo)致在DNA序列上單個核苷酸的變異產(chǎn)生的DNA序列多態(tài)性。目前SNP標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于遺傳性疾病的檢測[37-38]、特定功能基因或片段的分型[39-40]、種群生物學(xué)特征、基因作圖以及數(shù)量性狀定位[41-42]等研究領(lǐng)域。SNP的廣泛應(yīng)用是建立在高通量檢測技術(shù)基礎(chǔ)之上的。

3.2.2.1 代表性寡核苷酸芯片分析 2003年，Dahl等在代表性差異分析方法(representative differential analysis，簡稱RDA)的基礎(chǔ)上研發(fā)出一種芯片分析技術(shù)，該技術(shù)借助反向雜交技術(shù)，將經(jīng)過熒光標(biāo)記的待測樣品與固定在玻片上的 10～70 bp寡核苷酸片斷進(jìn)行雜交，通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)檢測雜交信號技術(shù)，對樣品序列信息進(jìn)行分析[43]。該技術(shù)主要用于檢測基因拷貝倍數(shù)的變化以及基因差異表達(dá)分析等方面。

3.2.2.2 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)標(biāo)簽 RAD是由Miller等在2007 年開發(fā)的一類高通量分子標(biāo)記，其是將酶切連接技術(shù)、PCR技術(shù)和短片段海量平行測序技術(shù)相偶聯(lián)的一種高效率的分子標(biāo)記技術(shù)[44]。該技術(shù)選擇不同的限制性內(nèi)切酶得到不同數(shù)量的RAD標(biāo)記。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)為作為簡化全基因組的代表在酶切位點(diǎn)附近進(jìn)行測序可發(fā)現(xiàn)較多的SNP標(biāo)記，快速、高效、成本較高。主要用于遺傳作圖[45-46]和定位突變分析[47-49]等領(lǐng)域。后來由美國康奈爾大學(xué)發(fā)展為通過測序基因分型(genotyping bysequencing，簡稱GBS)，使其具備了低成本高通量的特征，該技術(shù)研究的前提是所研究的物種已經(jīng)完成基因組測序。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以同時對大量的樣本進(jìn)行測序，大大降低了測序成本；缺點(diǎn)是只適合于已有基因組草圖的基因組重測序。2014年中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所的夏志強(qiáng)等在RAD技術(shù)的基礎(chǔ)上研發(fā)出了改進(jìn)重測序技術(shù)[50](amplified fragment SNP and methylation，簡稱AFSM)，即首先根據(jù)基因組的大小進(jìn)行設(shè)計選擇標(biāo)簽，通常在50～100個范圍內(nèi)，待測基因組DNA樣品進(jìn)行混合并用雙限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，并將酶切產(chǎn)物及時與選擇標(biāo)簽接頭連接，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)來構(gòu)建混合池；最后進(jìn)行高通量測序并進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study，簡稱GWAS)。GWAS通常是建立在基因組測序基礎(chǔ)上，需要有足夠覆蓋基因組的分子標(biāo)記以及能對大量分子標(biāo)記同時檢測的高通量技術(shù)。基因組學(xué)的迅速發(fā)展為種質(zhì)評價和分子育種提供了新的契機(jī)，GWAS成為發(fā)掘優(yōu)異基因資源和基因組輔助選擇育種的重要工具。

4 結(jié)束語

分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展對生物遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的拓展起到了非常重要的作用。分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于性狀標(biāo)記、遺傳多樣性分析、基因定位和克隆、構(gòu)建遺傳圖譜、親緣關(guān)系鑒定、物種進(jìn)化及分類關(guān)系等方面。隨著低成本、高通量以及高精度基因組DNA 測序新技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)將會展現(xiàn)更為廣闊的應(yīng)用前景。人類對海洋生物領(lǐng)域的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于常規(guī)作物的研究，因此本文重點(diǎn)介紹了分子標(biāo)記技術(shù)的選擇方法，希望能夠?qū)Ｑ笊锓N質(zhì)資源調(diào)查研究、海洋生物重要經(jīng)濟(jì)性狀基因的分子標(biāo)記篩選技術(shù)、海洋生物分子輔助育種技術(shù)、海水養(yǎng)殖品種的遺傳改良技術(shù)及新品種選育研究等方面提供參考。