宋霄鵬，王冠穎，李 玥，馬天文，白 薈，張志恒，高 利

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學(xué)重點實驗窒，黑龍江哈爾濱 150030)

馬骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種臨床常見的關(guān)節(jié)退行性疾病。OA引起的跛行是影響馬使用的比較嚴重的疾病。OA的診斷依賴于晚期不可逆階段的臨床癥狀和影像學(xué)檢查。缺乏早期敏感的血清或滑液生物標志物。此外，在馬OA發(fā)病過程中，關(guān)節(jié)軟骨損傷是主要特征，產(chǎn)生軟骨代謝降解產(chǎn)物分泌到關(guān)節(jié)滑液(synovial fluid,SF)中。生物標志物可以在影像學(xué)跡象出現(xiàn)之前的早期階段檢測到OA[2]。推測生物標志物可以預(yù)測馬OA，監(jiān)測治療進展，并可用于評估馬OA的發(fā)病程度。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，體液中的部分生物標志物在OA診斷方面的作用日益受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，其中Ⅱ型膠原(collagen Ⅱ,CⅡ)的代謝產(chǎn)物已成為研究的熱點之一。

C2C是Ⅱ型膠原C末端3/4長度的裂解碎片，C2C只在Ⅱ型膠原降解時產(chǎn)生。有學(xué)者認為，C2C在OA患者尿液中升高[3]。但目前尚未有研究發(fā)現(xiàn)C2C對OA診斷的定量研究，為能及早發(fā)現(xiàn)、干預(yù)、治療，從而延緩馬OA的疾病發(fā)展。試驗旨在采用夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定馬OA模型SF中C2C濃度，探討馬OA疾病發(fā)展與SF中C2C濃度的關(guān)系，為進一步實現(xiàn)馬OA滑液中生物標志物的檢測達到能早期診斷馬骨關(guān)節(jié)炎，進而緩解我國診斷、治療馬OA的經(jīng)濟壓力，達到早期預(yù)防的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 于黑龍江省肇東市某養(yǎng)殖場購進13匹蒙古馬，平均體重為420 kg(331 kg～487 kg)，平均年齡7歲(6歲～8歲)，對每匹馬進行體況評分[1]，得分均在4分～6分之間，無肢蹄病史且臨床檢查沒有肢蹄病癥狀。將該13匹馬隨機分為試驗組(n=8)和對照組(n=5)。試驗前，將馬匹栓養(yǎng)在硬場地上隨意采食飼料飼養(yǎng)2周，以適應(yīng)環(huán)境。

1.1.2 試劑 鹽酸美沙酮、鹽酸地托咪定、生理鹽水均購于Sigma公司；馬C2C成品ELISA試劑盒，批號070082Eq，購于上海賽默生物科技發(fā)展有限公司；兩性霉素B，批號1633C219，購于Amresco公司。

1.2 方法

1.2.1 造模 將13匹蒙古馬隨機分為兩組，試驗組8匹，對照組5匹。試驗開始前，給馬靜脈注射鹽酸美沙酮(0.1 mg/kg)和鹽酸地托咪定(0.1 μg/kg)進行鎮(zhèn)靜。造模組在馬左側(cè)腕關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入2 mL無菌的兩性霉素B稀釋液(25 mg/mL)，誘導(dǎo)馬OA模型。對照組關(guān)節(jié)腔注入2 mL無菌的生理鹽水。

1.2.2 關(guān)節(jié)滑液采集及臨床指標檢測 在注射兩性霉素B之前所有馬匹收集0.5 mL～1 mL的關(guān)節(jié)滑液，在注射藥物建立馬OA模型后每周采取滑液一次直至第9周試驗結(jié)束。無菌條件下，在EP管中收集樣品。于1 h內(nèi)將收集樣品以10 000 r/min離心15 min，取上清液，并儲存-80℃?zhèn)溆?，每周采用ELISA試劑盒測定試驗組和對照組馬SF中C2C的濃度，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。每次收集SF后，記錄馬的直腸溫度，呼吸頻率，脈搏和腕關(guān)節(jié)周長。此外，跛行每周評估一次，并使用美國馬獸醫(yī)協(xié)會(AAEP)分級標準進行跛行評估，具體情況如下：馬在行走時跛行很難被發(fā)現(xiàn)，在特定的環(huán)境(如負重、轉(zhuǎn)圈、斜面和硬地面) 下出現(xiàn)的間斷性明顯跛行為1級跛行；馬在正常行走或沿直線行走時跛行很難被發(fā)現(xiàn)，在特定的環(huán)境(如負重、轉(zhuǎn)圈、斜面和硬地面) 下出現(xiàn)的持續(xù)性明顯跛行為2級跛行；在任何情況下都出現(xiàn)的明顯跛行為3級跛行；伴隨低頭和步幅縮小的明顯跛行為4級跛行；在最小負重條件下出現(xiàn)不愿走動或處于休息狀態(tài)的跛行為5級跛行。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)做重復(fù)測量方差分析和t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果表示為平均值±標準差。P<0.05為差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

所有馬匹在注射兩性霉素B之前都無跛行，其他臨床癥狀均正常。兩性霉素B注射導(dǎo)致腕關(guān)節(jié)周長顯著增加(圖1)，在建立馬OA模型后的前2周，馬表現(xiàn)1級跛行。在3周～5周表現(xiàn)2級跛行，6周～8周表現(xiàn)3級跛行，第9周表現(xiàn)5級跛行，證明馬出現(xiàn)疼痛感和炎性腫脹，造模成功。左腕關(guān)節(jié)注射無菌生理鹽溶液并未導(dǎo)致跛行。

*與對照組比較差異性顯著(P<0.05)* Significant difference compared with the control group (P<0.05)

2.2 關(guān)節(jié)滑液中C2C濃度變化

與對照組相比，在9周內(nèi)C2C濃度隨OA發(fā)病時間的增加而升高(圖2)，從第2周開始顯著增加(P<0.05)，第4周開始極顯著增加(P<0.01)并保持增加趨勢直到第9周。

3 討論

馬OA主要特征表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的降解，關(guān)節(jié)軟骨主要由是由Ⅱ型膠原纖維(CⅡ)及特異型軟骨組成。

*與對照組比較差異性顯著(P<0.05)，**與對照組比較差異性極顯著 (P<0.01)

* Significant difference compared with the control group (P<0.05),** Extremely significant difference compared with the control group (P<0.01)

圖2關(guān)節(jié)滑液中C2C濃度在9周內(nèi)的變化

Fig.2 Changes in C2C concentrations in synovial fluid within 9 weeks

軟骨組織是Ⅱ型膠原的唯一來源，其約占軟骨干重的60%，因此對Ⅱ型膠原代謝產(chǎn)物的檢測可評估軟骨的降解[4]。C2C是Ⅱ型膠原C末端3/4長度的裂解碎片，作為判斷Ⅱ型膠原裂解的主要片段，國內(nèi)外研究學(xué)者在獸醫(yī)臨床和人類醫(yī)學(xué)方面做了相應(yīng)的研究。在人類OA研究中發(fā)現(xiàn)，患病關(guān)節(jié)SF中C2C濃度顯著增加，且濃度的升高程度與損傷程度有關(guān)[6]。此外，在建立狗OA模型后，第3周和第12周SF中C2C濃度顯著升高。和對照組比較，在造模后12周后，尿液和血清中C2C濃度顯著升高[3]。但也有學(xué)者認為，OA患者的SF、血清和尿液中C2C濃度沒有顯著的不同，得出結(jié)論為C2C在作為OA病理指標時濃度變化不穩(wěn)定[5]。

在本研究中，我們使用關(guān)節(jié)內(nèi)注射兩性霉素B誘導(dǎo)馬OA模型，在此前用此方法成功建立動物模型[6]。驢的OA模型由Mokbel A N等[7]建立，3周后出現(xiàn)輕度癥狀，6周后出現(xiàn)中度癥狀，9周出現(xiàn)嚴重癥狀。關(guān)節(jié)疾病是馬的常見疾病，影響馬的健康和使用價值，在診斷上也沒有特別快速有效的方法，馬的腕關(guān)節(jié)比較大，關(guān)節(jié)液量多，檢測關(guān)節(jié)液中的指標可以為馬關(guān)節(jié)疾病的診療提供方向。本試驗通過化學(xué)方法誘導(dǎo)建立馬OA模型，相比手術(shù)方法誘導(dǎo)OA模型可以減少創(chuàng)傷性滑膜炎的發(fā)生機率。在馬的腕關(guān)節(jié)內(nèi)注入兩性霉素B，可以觀測到在注射藥物后的第3周開始出現(xiàn)不同程度的OA臨床癥狀，出現(xiàn)不同程度的跛行，同時伴隨關(guān)節(jié)腫脹。此外，馬OA模型是用于評估人類OA相關(guān)病理學(xué)良好的翻譯模型[8]。由于缺乏檢測馬早期OA的生物標志物，所以本研究通過檢測SF中Ⅱ型膠原分解代謝產(chǎn)物中C2C濃度，直接準確的探討C2C濃度與關(guān)節(jié)軟骨病變程度間的關(guān)系。在狗與鼠的OA研究中，受損傷的關(guān)節(jié)SF中C2C濃度增加[9]。在羊的實驗性O(shè)A模型中，關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生增厚型損傷，C2C濃度增加[10]。此外，在馬OA研究中，SF中C2C的濃度顯著增加[11]，在試驗性O(shè)A早期出現(xiàn)同樣的變化[12]。在整個試驗過程中，對照組在注射生理鹽水后在9周內(nèi)C2C無明顯變化，試驗組在注射兩性霉素B后用ELISA方法檢測SF中C2C濃度，結(jié)果顯示從第2周開始顯著增加(P<0.05)，第4周開始極顯著增加(P<0.01)并保持增加趨勢直到第9周試驗結(jié)束。試驗組在關(guān)節(jié)內(nèi)注射兩性霉素B后第3周開始出現(xiàn)不同程度跛行，并且在跛行前就已經(jīng)出現(xiàn)了C2C濃度的顯著升高，這一結(jié)果與人OA病變過程中C2C變化趨勢相符。

結(jié)果證明Ⅱ型膠原降解發(fā)生在馬骨關(guān)節(jié)臨床癥狀出現(xiàn)之前，并且SF中Ⅱ型膠原降解產(chǎn)物C2C濃度升高。由此推測C2C可以作為馬早期OA診斷的生物標志，文中使用的臨時模型有助于識別在馬關(guān)節(jié)疾病中發(fā)生變化的生物標志物來評估OA治療。