隋 明，朱克永,張崇軍,王靜霞，唐賢華,周榮清

(1.四川工商職業(yè)技術(shù)學院，四川都江堰 611830；2.四川大學輕紡與食品學院，四川成都 610000；)

黃曲霉毒素主要由曲霉屬真菌中黃曲霉菌和寄生曲霉菌在生長過程中產(chǎn)生的一種次生代謝產(chǎn)物，主要包括黃曲霉毒素B1、B2、G1等10多種，其中以黃曲霉毒素B1毒性最強[1-2]。黃曲霉毒素廣泛存在環(huán)境中的土壤、植物果實中，主要以發(fā)霉及污染的玉米和花生中含量較高，對人和動物具有致畸、致癌、致突變作用[3]。人攝入過量的黃曲霉毒素時,會引起人的急性中毒及致癌，被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構(gòu)列為Ⅰ類致癌物，食品中黃曲霉毒素能給人和動物的健康造成嚴重的威脅[4-5]。乳酸菌是主要存在于人和動物體內(nèi)的一種有益菌，可以有效調(diào)整胃腸道內(nèi)菌群動態(tài)平衡，抑制腐敗菌生長及腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)生，另外，對黃曲霉毒素B1有一定的吸附與抑制作用[6]?？莶菅堪麠U菌是一種常用的發(fā)酵食品菌種，該菌自身可以合成多種酶類物質(zhì)，這些酶類物質(zhì)不僅可以促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，還可以抑制腸道內(nèi)條件致病菌，被廣泛應用于食品生產(chǎn)中[7]。關(guān)于乳酸菌抑制黃曲霉菌研究比較多，但是枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物是否可抑制黃曲霉菌未見相關(guān)報道。因此，本試驗選用了枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物對黃曲霉菌生長及產(chǎn)毒進行研究，為進一步研發(fā)黃曲霉菌抑制劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 產(chǎn)毒黃曲霉菌CGMCC3.4408標準菌株、枯草芽胞桿菌菌株、乳酸菌菌株由四川大學輕紡與食品學院實驗室保存。

1.1.2 試劑與儀器 MRS培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、產(chǎn)毒培養(yǎng)基均購自北京奧星生物技術(shù)公司；AFB1檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；隔水式恒溫培養(yǎng)箱由上海恒科學儀器有限公司生產(chǎn)；全波長酶標儀由德國eppendour公司生產(chǎn)；PBST、培養(yǎng)皿、EP管、移液槍、分析天平及分析純等常規(guī)試劑及儀器由本實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 黃曲霉菌培養(yǎng)與孢子計數(shù) 將黃曲霉菌CGMCC3.4408標準菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4 d～8 d后，挑取單個菌落進行擴大培養(yǎng)。取擴大培養(yǎng)的黃曲霉菌培養(yǎng)基，加入一定量的無菌的PBST，將用黃曲霉菌洗脫后，收集到EP管中，用無菌的PBST 8 000 r/min 5 min洗滌3次后，再用無菌紗布過濾3次除去黃曲霉菌孢子的菌絲，進行計數(shù)。用無菌的PBST調(diào)整黃曲霉菌孢子濃度為1×108cfu/mL備用。

1.2.2 枯草芽胞桿菌和乳酸菌培養(yǎng)與計數(shù) 將枯草芽胞桿菌菌株復蘇后接種LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12 h后，接種在MRS培養(yǎng)基中增殖3代后，進行計數(shù)，用MRS培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為1×108cfu/mL；將乳酸菌菌種接種MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h～48 h，用MRS培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為1×108cfu/mL；將枯草芽胞桿菌、乳酸菌按照1∶1比例制成混合培養(yǎng)物。

1.2.3 黃曲霉菌菌落生長抑制率測定 取枯草芽胞桿菌、乳酸菌及枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物各1 mL，分別涂布PDA培養(yǎng)基上，待中藥水提物藥液液體完全被吸收后，在PDA培養(yǎng)基中心接種20 μL黃曲霉菌孢子懸液(1×108cfu/mL)，28℃進行培養(yǎng)，分別在黃曲霉菌培養(yǎng)后48、72、96 h測量菌落大小。每種益生菌做10個重復，并10個重復的結(jié)果平均值進行統(tǒng)計與計算不同益生菌對霉菌生長的抑制率。對照組在PDA培養(yǎng)基上直接接種20 μL黃曲霉菌孢子懸液(1×108cfu/mL)。黃曲霉菌生長抑制率(%)=(空白對照組菌落直徑-試驗組菌落直徑)/空白對照組菌落直徑×100。

1.2.4 黃曲霉菌孢子生長抑制率測定 取5 mL的察氏培養(yǎng)基分別加入等量的枯草芽胞桿菌、乳酸菌、枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物，分別接種500 μL的黃曲霉胞子孢液(1×108cfu/mL)，每種益生菌做10個重復，28℃振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)后的6、18、24 h取出每種益生菌培養(yǎng)液各0.1 mL均勻涂布PDA平板，28℃培4 h～8 d后，對照組取5 mL的察氏培養(yǎng)基接種500 μL的黃曲霉胞子孢液(1×108cfu/mL)，對黃曲霉菌孢子進行計數(shù)。黃曲霉菌胞子孢生長抑制率計算公式為：抑制率(%)=(空白對照組孢子數(shù)-試驗組孢子數(shù))/空白對照組孢子數(shù)×100。

1.2.5 黃曲霉菌產(chǎn)毒量的測定 無菌條件下，在產(chǎn)毒培養(yǎng)基中均勻涂布2 mL甘油水溶液，待液體完全被吸收，分別接種黃曲霉菌孢子生長抑制率試驗中，用枯草芽胞桿菌、乳酸菌、枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物培養(yǎng)6、18、24 h后培養(yǎng)液0.1 mL分別接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基，35℃恒溫培養(yǎng)15 d～20 d；空白對照組，將無菌的生理鹽水和黃曲霉胞子孢液(1×108cfu/mL)按照1∶1比例配合均勻后，取0.1 mL用同樣方法接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，35℃恒溫培養(yǎng)15 d～20 d。試驗結(jié)束后提取黃曲霉菌，并按照AFB1檢測試劑盒進行測定其產(chǎn)毒量。霉菌產(chǎn)毒量抑制率(%)=(空白對照組產(chǎn)毒量-試驗組產(chǎn)毒量)/空白對照組產(chǎn)毒量×100。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗結(jié)果以平均值±標準差表示，試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析，采用Duncan′s 法進行均值比較，以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 黃曲霉菌菌落生長抑制率測定結(jié)果

由表1可知，3種不同類型的益生菌處理組對黃曲霉菌菌落生長有不同程度的抑制效果，在培養(yǎng)48 h時，枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物處理組對黃曲霉菌菌落生長率均高于枯草芽胞桿菌和乳酸桿菌處理組，但是差異不顯著(P>0.05)；隨著培養(yǎng)時間的延長，3種不同類型的益生菌處理組對黃曲霉菌菌落生長抑制效果也有所增加，在培養(yǎng)72 h和96 h時，枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物處理組對霉菌菌落生長率分別與枯草芽胞桿菌和乳酸菌處理組相比較，差異顯著(P<0.05)，枯草芽胞桿菌和乳酸桿菌2個組處理組之間差異不顯著(P>0.05)。

表1 不同類型的益生菌對黃曲霉菌菌落生長抑制率測定結(jié)果(%)

注：同列數(shù)據(jù)肩標相同字母或無字母為差異不顯著(P>0.05)，不同字母為差異顯著(P<0.05)。

Note:There is no significant difference in the same column data with same letters or without letter (P>0.05),and the difference with different letters is significant (P<0.05).

2.2 黃曲霉菌孢子生長抑制率測定結(jié)果

由表2可知，3種不同類型的益生菌處理組對黃曲霉菌菌孢子生長有不同程度的抑制效果，在培養(yǎng)6 h、18 h、24 h時，枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物處理組對黃曲霉菌孢子的抑制率均高于枯草芽胞桿菌處理組和乳酸菌處理組，差異顯著(P<0.05)，枯草芽胞桿菌處理組與乳酸菌處理組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.3 黃曲霉菌產(chǎn)毒量的測定結(jié)果

由表3可知，3種不同類型的益生菌處理組對黃曲霉菌產(chǎn)毒量有不同程度的抑制效果，在培養(yǎng)6 h時，枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物處理組對黃曲霉菌孢子的抑制率均高于枯草芽胞桿菌處理組和乳酸菌處理組，但是差異不顯著(P>0.05)；在培養(yǎng)18 h、24 h時，枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物處理組對黃曲霉菌產(chǎn)毒與枯草芽胞桿菌處理組、乳酸菌處理組相比較，差異顯著(P<0.05)，枯草芽胞桿菌處理組與乳酸菌處理組之間差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同類型的益生菌對黃曲霉菌孢子生長抑制率測定結(jié)果(%)

注：同列數(shù)據(jù)肩標相同字母或無字母為差異不顯著(P>0.05)，不同字母為差異顯著(P<0.05)。

Note:There is no significant difference in the same column data with same letters or without letter (P>0.05),and the difference with different letters is significant (P<0.05).

表3 不同類型的益生菌對黃曲霉菌產(chǎn)毒量抑制率測定結(jié)果(%)

注：同列數(shù)據(jù)肩標相同字母或無字母為差異不顯著(P>0.05)，不同字母為差異顯著(P<0.05)。

Note:There is no significant difference in the same column data with same letters or without letter (P>0.05),and the difference with different letters is significant (P<0.05).

3 討論

人的黃曲霉毒素中毒主要來源是食品，由于黃曲霉菌廣泛存在環(huán)境中或者發(fā)霉變質(zhì)的食品原料中，食品在加工過程中易受到黃曲霉毒素的污染，當人食用了被黃曲霉菌污染的食品，黃曲霉毒素主要積蓄在肝臟，導致肝臟解毒功能下降，還可以在人體內(nèi)產(chǎn)生毒素，毒素隨著血液循造成人全身的中毒狀態(tài)，嚴重著可導致死亡[8]。有效控制黃曲霉菌生長和產(chǎn)毒量，才能減少食品中黃曲霉毒素污染。黃曲霉毒素清除方法主要包括物理方法、化學方法和生物去毒法，其中生物去毒法被方法被廣泛應用[9-10]。許多研究表明乳酸桿菌等益生菌對黃曲霉素毒素具有一定吸附作用。姚婉等[11]研究表明富硒乳酸菌抑制黃曲霉菌生長以及產(chǎn)毒具有很好抑制效果。EraslanG等[12]研究表明在黃曲霉菌培養(yǎng)過程中添加乳酸菌可以抑制黃曲霉菌生長。

國內(nèi)關(guān)于乳酸菌抑制黃曲霉菌研究比較多，但是枯草芽胞桿菌和乳酸桿菌抑制黃曲霉菌未見報道。因此，本試驗將枯草芽胞桿菌和乳酸桿菌按照1∶1比例制成混合培養(yǎng)物，進一步驗證對混合培養(yǎng)物對黃曲霉菌生長及產(chǎn)毒影響。結(jié)果顯示，枯草芽胞桿菌和乳酸桿菌混合培養(yǎng)物對黃曲霉菌菌落生長抑制率、黃曲霉菌孢子生長抑制率及黃曲霉產(chǎn)毒量均高于枯草芽胞桿菌和乳酸桿菌，差異顯著(P<0.05)，因而證實了枯草芽胞桿菌和乳酸桿菌混合物有效抑黃曲霉菌生長和產(chǎn)毒量。從而證實許多枯草芽胞桿菌可以提高乳酸桿菌對黃曲霉菌落生長、黃曲霉孢子生長和黃曲霉菌產(chǎn)毒量，兩者具有協(xié)同作用。枯草芽胞可以分泌枯草菌素及短桿菌肽等多種活性化學物質(zhì)，這些活性化學物質(zhì)可以抑制外界的病菌、毒素等異物?？赡苡捎诳莶菅堪置诘幕钚曰瘜W物質(zhì)可以抑制黃曲霉菌的生長，吸附或者分解黃曲霉菌所產(chǎn)生的毒素，從而提高黃曲霉菌菌落和生長抑制率及產(chǎn)毒量抑制率?？莶菅堪麠U菌和乳酸桿菌等益生菌對黃曲霉毒素菌作用機理復雜，有待進一步研究。