成嘉祁，龔蕓蕓，謝海靜，李宏亮，戚龍菊

(1.南通大學醫(yī)學院，江蘇南通 226001；2.南通大學杏林學院，江蘇南通 226001；3.南通市第三人民醫(yī)院，江蘇南通 226001；4.南通大學護理學院，江蘇南通 226001)

美國2017年癌癥報告顯示，年度新增肝膽癌癥患者40 710人(男性29 200人，女性11 510人，死亡人數(shù)為28 920人(男性19 610人，女性9 310人)，死亡率占腫瘤死亡率的4.813%[1]。我國是肝癌高發(fā)的國家之一，每千人中年度新增患者466.1人(男性343.7人，女性122.3人)，年度死亡人數(shù)為422.1人(男性310.6人，女性111.5人)，占腫瘤死亡率的10.861%[2-3]。肝纖維化(Hepatic fibrosis)常見于肝臟慢性損傷后的修復過程，由于細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成高于降解，進而過度沉積，破壞肝臟結(jié)構(gòu)和功能，導致肝臟衰竭，并逐步向肝硬化和肝癌發(fā)展，預后極差[4]。由于早期診斷手段的缺乏以及癥狀不易察覺，導致大多數(shù)肝病患者就診時已經(jīng)出現(xiàn)肝硬化甚至肝癌癥狀，給家庭和社會醫(yī)療體系造成較大的負擔，而國內(nèi)外目前尚未有有效的治療藥物方法[5-6]。

肝臟的損傷和纖維化會導致臟器局部循環(huán)減弱，產(chǎn)生缺氧而促進病程的惡化[7-9]。低氧環(huán)境和組織纖維化誘導炎癥反應的產(chǎn)生，而炎癥又加重缺氧，因此控制局部炎癥反應對于治療和逆轉(zhuǎn)肝纖維化十分必要[10-12]?？祻椭委熓侄卧谂R床上已逐步應用于腫瘤患者的輔助治療[13-15]，并在動物腫瘤模型中獲得了驗證[16-17]。其中采用不同運動負荷組合交替進行，組間充分休息的有氧間歇運動訓練(aerobic interval training，AIT)可以促進肝臟局部供氧，改變代謝方式，有效緩解腫瘤患者疲勞，但其在肝纖維化過程中的作用機制并未研究清楚[7,18-19]?？傸S酮具有抗氧化、抗炎癥、抗病毒等作用，已有研究報道表明枳椇子、歐芹根、黃芪及荔枝等植物總黃酮具有治療病毒性和酒精性肝炎的作用[20-22]。青蒿素抗瘧效果顯著，隨之對青蒿提取物研究方興未艾，但青蒿總黃酮是否對肝纖維化具有抑制作用并未見報道。本研究以肝纖維化小鼠為模型，利用青蒿總黃酮聯(lián)合有氧運動的治療方案，觀察二者單獨及聯(lián)合使用對小鼠肝纖維化的保護作用及其對炎癥因子水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 青蒿總黃酮為西安賽邦醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品；ConA為美國Sigma公司產(chǎn)品；實時熒光定量PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Trizol為南京諾維贊生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Masson染色試劑盒為索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品；IL-1β、IL-10、IL-6以及TNF-α檢測試劑盒為武漢優(yōu)爾生公司產(chǎn)品；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.1.2 儀器 小鼠實驗跑臺(ZH-PT)，安徽正華生物儀器有限公司，實時熒光定量PCR儀，Applied Biosystems，Eppendorf冷凍離心機，酶標儀。

1.1.3 實驗動物 健康雄性SPF級Balb/c小鼠60只，4周齡，體重20 g～22 g，購自南通大學實驗動物中心。正常飼養(yǎng)3 d以適應環(huán)境。5只/籠，相對濕度40%～70%，12 h/12 h明暗周期光照，溫度為22℃～25℃，自由采食和飲水。實驗動物飼養(yǎng)及取材操作規(guī)程獲得南通大學實驗動物管理委員會的批準，并嚴格遵守。

1.2 方法

1.2.1 造模 以12.5 μg/g體重劑量每周一次尾靜脈注射ConA的氯化鈉溶液，持續(xù)8周，最終存活個體作為實驗對象。隨機抽取3只小鼠進行肝纖維化評價以確定是否造模成功。

1.2.2 分組與給藥 造模成功后小鼠40只隨機平均分為總黃酮組(FLA組)，運動組(TM組)，混合治療組(FTM組)，模型組(Model組)。FLA組0.4 mg/g劑量于每日上午進行灌胃；TM組采用AIT方案進行跑臺；FTM組于每日上午以0.4 mg/g的劑量灌胃，下午進行AIT跑臺，運動方案同TM組；Model組正常飼養(yǎng)。共持續(xù)6周。

1.2.3 運動方案 AIT處理的小鼠在實驗前以10 m/min步速訓練5 d，并測定最大跑速(Maximal speed)。小鼠先以10 m/min速度熱身5 min，隨之跑臺速度以3 m/min增加直至小鼠出現(xiàn)運動失調(diào)，疲勞癥狀，以之為最大跑速。實驗開始后，TM和FTM組小鼠以最大跑速的60%運動60 min，5 d/周，持續(xù)6周[23]。

1.2.4 動物樣本取材 30 mL/L的水合氯醛麻醉小鼠，心臟采血1 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上層血清，置-80℃?zhèn)溆?；頸椎脫臼處死小鼠，開腹，取肝臟組織100 mg，生理鹽水沖洗，置于1.5 mL離心管中，加入1 mL的Trizol，液氮冷凍，置-80℃?zhèn)溆茫蝗「闻K組織300 mg，生理鹽水沖洗，置于40 mL/L PFA中固定，次日行脫水，透明，浸蠟包埋，做5 μm切片。

1.2.5 Masson染色 烘片2 h，梯度入水。臨用時取等量的Weigert染液A與Weigert染液B混合成為鐵蘇木素染液，染色6 min；酸性乙醇分化30 s，水洗后返藍1 min，水洗1 min；麗春紅品紅染色5 min，用弱酸工作液浸泡1 min；磷鉬酸溶液洗2 min，弱酸溶液浸泡1 min；苯胺藍染色4 min。弱酸溶液浸泡1 min；用950 mL/L乙醇迅速脫水；無水乙醇， 30 s×3；二甲苯，5 min×3；封片并鏡檢。

1.2.6 ELISA檢測 IL-1β、IL-10以及TNF-α檢測按照試劑盒所提供說明書進行操作[24]。

1.2.7 Real-time PCR檢測 常規(guī)Trizol-氯仿法提取各組動物肝臟RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板，用熒光定量PCR反應Kit對IL-1β、IL-10、IL-6以及TNF-α表達量進行檢測。反應程序為:94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，總循環(huán)40次。從NCBI下載基因序列，使用Primer 6.0進行引物設計，BLAST預測擴增特異性。引物序列見表1。

1.2.8 統(tǒng)計分析 采用SPSS22.0分析檢測所得結(jié)果。各組中死亡小鼠不計入統(tǒng)計量。多組間均數(shù)比較采用方差分析；用t檢驗方差齊性，不齊者采用矯正t檢驗；對變異較大組比較采用秩和檢驗。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 肝臟纖維化程度的變化

各組小鼠肝切片Masson染色結(jié)果顯示，Model組小鼠肝臟中膠原纖維(藍色)表達量顯著增多，呈現(xiàn)彌漫性，并且互相粘連成片，形成區(qū)域斑塊樣分布，又以血管周圍和匯管區(qū)為主；FLA組藍色纖維分布較少，主要集中于匯管區(qū)和血管周圍，但紅色的肌纖維呈點狀分布；TM組中藍色膠原纖維表現(xiàn)為散發(fā)性分布，但并未粘連成片，未見斑塊樣區(qū)域；FTM組肝臟組織中偶見些許藍色纖維，并且纖維長度較短，寬度較窄(圖1)。

2.2 肝臟組織中炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平的變化

實時定量熒光PCR結(jié)果表明，與Model組相比，F(xiàn)LA組TNF-α的表達量顯著下降(P<0.01)，TM組顯著下降(P<0.05)，而FTM組中則極顯著下降(P<0.001)。與FLA組相比，F(xiàn)TM組中TNF-α的表達量顯著下降(P<0.05)，與TM組相比，F(xiàn)TM組表達量則極顯著下降(P<0.01)；與Model組相比，F(xiàn)LA組及TM組中IL-1β的表達量顯著下降(P<0.05)，而FTM組中則極顯著下降(P<0.01)。與FLA組及TM組相比，F(xiàn)TM組中IL-1β的表達量顯著下降(P<0.05)；與Model組相比，F(xiàn)LA組、TM組及FTM組中IL-6的表達量均顯著下降(P<0.05)，與FLA組及TM組相比，F(xiàn)TM組中IL-6的表達量均顯著下降(P<0.05)；與Model組相比，F(xiàn)LA組及TM組中IL-10的表達量顯著上升(P<0.05)，而FTM組中則極顯著上升(P<0.01)。與FLA組及TM組相比，F(xiàn)TM組中IL-10的表達量顯著上升(P<0.05)(表2)。

A.模型組小鼠肝臟切片Masson染色(40×)，比例尺=50μm; B.黃酮組小鼠; C.運動組小鼠; D.復合組小鼠，放大倍數(shù)及比例尺同A.

A.Masson staining of the liver sections in model group mice (x40),scale bar=50 μm; B.FLA group; C.TM group; D.FTM group,the parameters were same as A.

圖1各組小鼠肝臟Masson染色(40×)

Fig.1 Masson staining of liver sections in mice of different groups(40×)

2.3 血清中炎癥因子含量的變化

ELISA結(jié)果表明，與Model組相比，F(xiàn)LA組及TM組血清中TNF-α的含量均極顯著下降(P<0.01)，而FTM組則呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.001)。與FLA組和TM組相比，F(xiàn)TM組血清中TNF-α的含量差異顯著(P<0.05)；與Model組相比，F(xiàn)LA組中IL-1β的含量極顯著下降(P<0.01)，TM組中顯著下降(P<0.05)，而FTM組中則極顯著下降(P<0.001)。與FLA組相比，F(xiàn)TM組中IL-1β的含量顯著下降(P<0.05)，與TM組相比，F(xiàn)TM組含量極顯著下降(P<0.01)；與Model組相比，F(xiàn)LA組及TM組中IL-10的表達量顯著上升(P<0.05)，而FTM組中則極顯著上升(P<0.01)。與FLA組及TM組相比，F(xiàn)TM組中IL-10的含量顯著上升(P<0.05)(表3)。

表2 各組小鼠肝臟組織中炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平的變化

注：與模型組比較：1.P<0.05，2.P<0.01 ，3.P<0.001 ；與黃酮組比較：4.P<0.05；與運動組比較：5.P<0.05，6.P<0.01。

Note:Compared with the model group,1.P<0.05,2.P<0.01,3.P<0.001; Compared with FLA group,4.P<0.05; Compared with the TM group,5.P<0.05,6.P<0.01.

表3 各組小鼠血清中TNFα、IL-1β、IL-10含量的變化

注：與模型組比較：1.P<0.01，2.P<0.001 ；與黃酮組比較：3.P<0.05；與運動組比較：4.P<0.05，5.P<0.01。

Note:Compared with the model group,1.P<0.05,2.P<0.01; Compared with the FLA group,3.P<0.001; Compared with the TM group,4.P<0.05,5.P<0.05.

3 討論

肝癌是世界上第二致死病因，每年全球有超過70萬人因此而死亡[25]。肝癌的發(fā)生過程中，肝臟纖維化是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)折點，并且肝纖維化評分與肝臟疾病、肝癌發(fā)生率以及死亡率呈正相關(guān)，因此肝纖維化程度能夠預示肝癌發(fā)生率[26]。肝臟纖維化往往會由于病毒、酒精、藥物以及遺傳因素等原因?qū)е赂闻K損傷，造成肝臟內(nèi)結(jié)締組織異常增生，進而使得彌漫性細胞外基質(zhì)在肝臟內(nèi)部過度沉積[27]。纖維化通常是各種慢性肝臟疾病發(fā)展的共同結(jié)果，也是肝硬化的必經(jīng)階段，更是肝細胞癌的前兆和關(guān)鍵節(jié)點[28]。由于肝臟纖維化是一個可逆的過程，故監(jiān)測和治療肝纖維化過程成為攻克肝癌的重要環(huán)節(jié)?；罨母闻K星狀細胞是肌成纖維細胞主要來源，肝臟中肌成纖維細胞通過合成并分泌膠原促進肝臟細胞外基質(zhì)的積累，導致肝纖維化的發(fā)生[28]。通過Masson染色可以清晰觀察到各組小鼠肝臟中膠原纖維的發(fā)生情況，模型組纖維化程度最高，總黃酮和運動干預能夠有效降低纖維化程度，但二者聯(lián)合使用抵抗肝臟纖維化能力顯著增強。

中藥在慢性病的治療過程中具有獨特的優(yōu)越性，肝纖維化在中醫(yī)中被認為是由于肝郁氣滯導致血瘀的產(chǎn)生，而血不養(yǎng)肝，因此需要清熱解毒，散淤消腫。鬼針草中黃酮類物質(zhì)能夠顯改CCl4引起的大鼠肝纖維化程度，抑制星狀細胞的活化和增殖[29]。趕黃草總黃酮能夠抑制大鼠酒精性肝纖維化，降低組織中過氧化物活性和濃度，抑制炎癥因子的表達[30]。青蒿提取物能夠抑制炎癥反應而誘導肝癌細胞的凋亡[31]，但青蒿總黃酮的功能并不清楚。本研究表明，青蒿總黃酮能夠有效抑制肝臟纖維化，并抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，提高抗炎因子IL-10的表達。

臨床早期康復訓練能夠改善乳腺癌患者術(shù)后體征指數(shù)[13,16]，并提高肝癌患者術(shù)后的排氣和焦慮狀態(tài)[14]，但康復訓練，尤其是AIT對于肝纖維化改善機制研究并不清楚。本研究中AIT能夠有效抑制刀豆蛋白A所導致的肝臟纖維化，但治療效果低于青蒿總黃酮組，可能是AIT只進行了6周，時間較短的緣故，尚需更長時間AIT進一步驗證。AIT和青蒿總黃酮聯(lián)合處理肝纖維化小鼠模型能夠有效遏制肝纖維化的進程，并促進逆轉(zhuǎn)過程，主要體現(xiàn)在膠原纖維長度縮短，體積變小。運動康復改善肝纖維化進程的機制也可能是通過抑制局部以及全身性炎癥反應而發(fā)揮作用的，局部轉(zhuǎn)錄水平檢測表明肝臟原位炎癥因子的表達水平被AIT顯著抑制，但抑制效果顯著低于聯(lián)合組，可能延長訓練時間會獲得更好的效果。AIT也能夠顯著抑制全身性炎癥免疫應答，血清中促炎因子TNF-α和IL-1β顯著下降，而抗炎癥因子IL-10含量則顯著升高。這也提示AIT在肝纖維化治療中與中藥相結(jié)合也許會增加臨床效用。

綜上所述，青蒿總黃酮聯(lián)合有氧間歇運動訓練具有更加明顯拮抗及逆轉(zhuǎn)肝臟纖維化的作用，進而阻止其進一步發(fā)展為肝硬化。青蒿總黃酮聯(lián)合AIT可以通過降低肝臟局部及外周血中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，促進抗炎因子IL-10的表達，降低局部炎癥反應，減輕肝臟損傷，進而發(fā)揮治療肝纖維化的效應。