李水生，左建玲，楊新林，張葆欣，王海峰*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)體育部，陜西楊凌 712100；2.河北北方學(xué)院公共體育部，河北張家口 075000；3.西安體育學(xué)院，陜西西安 710068)

隨著老年化趨勢的加劇，骨質(zhì)疏松癥已成為全球范圍內(nèi)的嚴(yán)重健康問題[1]。絕經(jīng)期骨量逐漸減少，從而誘發(fā)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[2]。值得注意的是，骨質(zhì)疏松癥伴隨著持久的疼痛、骨變形、易骨折等[3]。鑒于骨量流失呈漸進(jìn)性且不可逆的特征，現(xiàn)階段暫無特效根治方法，需重視早期干預(yù)[4]。

運(yùn)動有利于刺激骨細(xì)胞生成[5]。同時，運(yùn)動增強(qiáng)肌力、提高平衡力，均可有利于降低該癥引發(fā)的骨折[6]。既往研究均強(qiáng)調(diào)了運(yùn)動在預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中的積極作用[7]。另外，中醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)辨證治療，從整體上施用毒副作用小的綜合調(diào)理措施[8]，因此從中醫(yī)藥中尋找治療骨質(zhì)疏松癥的藥物意義顯著。既往有研究顯示中藥淫羊藿醇提物、杜仲-牛膝配伍均可顯著改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥療效[9-10]，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。運(yùn)動聯(lián)合早期中藥治療骨質(zhì)疏松癥研究不多，本文構(gòu)建絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型，初步探討運(yùn)動聯(lián)合早期中藥治療對骨質(zhì)疏松癥的干預(yù)及機(jī)制，以期為骨質(zhì)疏松癥的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取40只3個月齡的雌性SD大鼠，體重260 g±6.00 g，實(shí)驗(yàn)動物由西安體育學(xué)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。所有大鼠均經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)于不銹鋼籠內(nèi)2周，通風(fēng)無菌，自由飲食飲水。保持相對濕度在60%左右，模擬晝夜明暗交替(12 h/12 h)，室溫在24℃±2℃內(nèi)。

1.1.2 主要儀器 大鼠跑臺儀(DS)，浙江段氏商貿(mào)有限公司產(chǎn)品；電子天平儀(JA2003)，上海天平儀器技術(shù)有限公司產(chǎn)品；雙能X射線骨密度測定儀(XR-36)，Norland公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)(HP8453)，惠普公司產(chǎn)品；實(shí)時定量PCR儀(SLAN)，上海宏石醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)(Biofuge 28RS)，Heraeus公司產(chǎn)品；凝膠成像儀(GEL DOC EZ IMAGER)，Bio-rad公司產(chǎn)品。

1.1.3 藥物和試劑 骨疏康顆粒，遼寧康辰藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；PCR試劑盒，QIAGEN公司產(chǎn)品；PCR引物，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；BCA蛋白濃度測定試劑盒，聚丙烯酰胺凝膠，武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；蛋白裂解液，碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PVDF膜，Millipore公司產(chǎn)品；Western blot抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠隨機(jī)分為5組，每組各8只，其中假手術(shù)組為正常對照，將其他大鼠去卵巢，構(gòu)建絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型，分為去卵巢組、單純運(yùn)動組、單純中藥治療組、運(yùn)動協(xié)同中藥治療組。

1.2.2 去卵巢骨質(zhì)疏松動物模型構(gòu)建 稱重大鼠，行腹腔內(nèi)注射麻醉(30 g/L戊巴比妥，50 mg/kg)。消毒后，行背部切口，逐層切開皮膚、骨骼、打開腹腔，定位雙側(cè)卵巢，使用鉗夾切除，隨后結(jié)扎、止血并縫合。假手術(shù)組手術(shù)麻醉及路徑同上，不做卵巢切除。術(shù)后切口消毒，并腹腔注射青霉素預(yù)防感染。

1.2.3 動物干預(yù)方案及取樣 手術(shù)后1周內(nèi)密切關(guān)注大鼠傷口狀況并預(yù)防感染。手術(shù)后第11周，對不同組別實(shí)施不同干預(yù)方案。假手術(shù)組、去卵巢組和單純運(yùn)動組蒸餾水灌胃(10 mL/kg)，每日1次。單純中藥治療組和運(yùn)動協(xié)同中藥治療組使用骨疏康(4.8 g/kg)灌胃，每日1次。同時，單純運(yùn)動組和運(yùn)動協(xié)同中藥治療組參照Bedford設(shè)計(jì)的動物運(yùn)動負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)[11]，行跑臺訓(xùn)練。各組大鼠每月稱重1次。

最后一次運(yùn)動或藥物治療結(jié)束24 h內(nèi)，脫頸處死大鼠。為確認(rèn)大鼠去卵巢手術(shù)成功，剪下大鼠子宮周圍脂肪組織，并稱重，子宮變細(xì)、重量減輕則為去卵巢成功。迅速游離股骨。取左側(cè)股骨遠(yuǎn)端并剔除周圍組織，40 g/L多聚甲醛固定，切片，HE染色；取左側(cè)股骨近端組織置于-80℃冰箱用于PCR檢測；右側(cè)股骨組織置于-80℃冰箱用于蛋白提取。

1.2.4 骨密度測定 采用XR-36型雙能X射線骨密度測定儀，檢測離體股骨組織骨密度(g/cm2)。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測 根據(jù)試劑盒說明提取大鼠股骨組織的總RNA，提取后的RNA以紫外分光光度計(jì)檢測各RNA樣本的OD260/OD280值，并計(jì)算RNA濃度，置-80℃保存?zhèn)溆谩Ｄ孓D(zhuǎn)錄cDNA根據(jù)試劑盒說明書操作。采用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)引物如下(表1)，設(shè)計(jì)引物均由上海生工公司合成。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR PremixExTaq10 μL，F(xiàn)orward Primer 0.8 μL， Reverse Primer 0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件為:95℃ 3 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，采集熒光信號，共35個循環(huán)。miR-21以GAPDH為內(nèi)參，取CT值(擴(kuò)增動力曲線拐點(diǎn))，按2-△△Ct計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

表1 PCR引物設(shè)計(jì)

1.2.6 Western blot檢測 從液氮中取出組織樣本，碾磨成粉，加入蛋白裂解液(1 mL)，混勻后靜置2 h，隨后進(jìn)行離心處理(12 000 r/min，30 min)，吸取上層蛋白提取液。按BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度，將提取的蛋白加入上樣緩沖液后在95℃煮10 min，每孔上樣30 μg，100 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電泳電壓80 V 轉(zhuǎn)120 V，濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜電壓100mV，時間45 min～70 min，PVDF轉(zhuǎn)膜，50 g/L BSA室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000稀釋，購自Abcam公司)，4℃過夜。TBST 漂洗，3次/5 min，相應(yīng)的二抗(1∶3 000稀釋)室溫孵育 2 h，洗膜，3次/5 min，化學(xué)發(fā)光試劑顯影。β-actin作為內(nèi)參。Bio-rad Gel Dol EZ 成像儀顯影。目的條帶采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動物體重比較

試驗(yàn)初，大鼠體重?zé)o明顯差異。治療結(jié)束時，去卵巢組體重最大，體重增長趨勢最明顯，與假手術(shù)組相比差異顯著(P<0.05)；各治療組體重增加趨勢明顯低于去卵巢組(P<0.05)；單純中藥治療組大鼠體重與運(yùn)動組無顯著差異(P>0.05)(表2)。

2.2 各組骨密度變化

運(yùn)動協(xié)同中藥治療組骨密度明顯高于去卵巢組、單純運(yùn)動組和單純中藥治療組，但未達(dá)到假手術(shù)組水平(P<0.05)；單純中藥治療組骨密度水平高于去卵巢組和單純運(yùn)動組(P<0.05)，但后兩組間無顯著差異(P>0.05)(表3)。

表2 各組大鼠治療前后體重變化對比

注：*表示與去卵巢組比較，P<0.05；#表示單純運(yùn)動組組與單純中藥治療組比較，P>0.05。

Note:*Compared to ovariectomized group,P<0.05; #Compared to exercise group and Chinese medicine treatment group,P>0.05.

表3 各組大鼠股骨骨密度對比

注：*表示與運(yùn)動協(xié)同中藥治療組比較，P<0.05；#表示單純中藥治療組比較，P<0.05。

Note:*Compared to sports combined with traditional Chinese medicine treatment group,P<0.05; #Compared to Chinese medicine treatment group,P<0.05.

2.3 各組骨組織HE染色對比

左側(cè)股骨近端組織的HE染色顯示去卵巢組骨小梁橫徑變窄且有斷裂現(xiàn)象、間隙增大、排列混亂，同時骨髓腔脂肪細(xì)胞明顯增多；假手術(shù)組、單純運(yùn)動組和單純中藥治療組骨小梁橫徑較寬且無斷裂、排列整齊；運(yùn)動協(xié)同中藥治療組骨小梁橫徑寬度大于去卵巢組、間隙減小，且骨髓腔細(xì)胞較去卵巢組減少(圖1)，圖1中由左往右依次為：假手術(shù)組、去卵巢組、單純運(yùn)動組、單純中藥治療組、及運(yùn)動協(xié)同中藥治療組。

圖1 左側(cè)股骨近端組織的HE染色(A骨小梁，B骨髓腔，100×)

2.4 PCR及western blot分別檢測Osterix和P-GSK-3β表達(dá)水平比較

與假手術(shù)組相比，去卵巢組Osterix的mRNA水平明顯降低；治療組水平提升，尤以運(yùn)動協(xié)同中藥治療組明顯提高，與去卵巢組相比差異顯著(P<0.05)；但單純運(yùn)動組與單純中藥治療組相比差異不顯著(P>0.05)(表4)。相比假手術(shù)組，去卵巢組大鼠P-GSK-3β蛋白表達(dá)顯著上升；各治療組P-GSK-3β蛋白表達(dá)明顯低于去卵巢組，且運(yùn)動協(xié)同中藥治療組水平最低(P<0.05)(圖2，表4)。

圖2 Western blot檢測P-GSK-3β蛋白表達(dá)

3 討論

骨質(zhì)疏松癥常伴有骨密度下降、骨強(qiáng)度減弱、骨折風(fēng)險(xiǎn)增高、慢性疼痛等特征。目前，醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域一直致力于如何實(shí)現(xiàn)安全有效的骨質(zhì)疏松癥的早期預(yù)防。

表4 PCR及Western blot分別檢測Osterix和P-GSK-3β表達(dá)水平

注：*表示與去卵巢組比較，P<0.05；#表示單純中藥治療組比較，P<0.05。

Note:*Compared to the sports combined with ovariectomized group,P<0.05; #Compared to Chinese medicine treatment group,P<0.05.

本研究通過構(gòu)建大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型，并以假手術(shù)操作大鼠為正常對照，以不加任何干預(yù)措施的去卵巢組為病理對照，同時另施加跑臺運(yùn)動干預(yù)、單純中藥干預(yù)以及運(yùn)動協(xié)同中藥干預(yù)3種干預(yù)模式，分析各組大鼠治療前后體重變化、治療后骨密度比較、以及Osterix和P-GSK-3β水平變化，以期為臨床尋找理想的早期干預(yù)骨質(zhì)疏松癥的治療措施。

手術(shù)切除大鼠雙側(cè)卵巢是最為廣泛應(yīng)用的構(gòu)建動物去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型的干預(yù)措施。本研究選用3月齡性成熟期的雌性大鼠構(gòu)建去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型，且體重變化明顯，去卵巢組大鼠體重上升趨勢明顯，骨密度測量顯示去卵巢組骨密度明顯下降，同時，骨組織切片亦提示骨小梁數(shù)量降低、腔隙增大、排列混亂。以上結(jié)果證實(shí)去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型的成功構(gòu)建。試驗(yàn)前各組體重?zé)o差異，治療結(jié)束體重對比發(fā)現(xiàn)，去卵巢組體重最大，體重增長趨勢最明顯；各治療組體重增加趨勢明顯低于去卵巢組；單純中藥治療組大鼠體重與運(yùn)動組無差異。提示單純中藥治療并不能有效控制絕經(jīng)后的體重增長趨勢，運(yùn)動協(xié)同中藥治療組可有效控制去卵巢相關(guān)的體重增加問題，進(jìn)一步提示聯(lián)合療法的協(xié)同優(yōu)勢。同時，前面已提及骨質(zhì)疏松癥主要特征是骨密度下降、骨強(qiáng)度減弱。對比各組骨密度變化趨勢是運(yùn)動協(xié)同中藥治療組骨密度明顯高于去卵巢組、單純運(yùn)動組和單純中藥治療組，但未達(dá)到假手術(shù)組水平；單純中藥治療組骨密度水平高于去卵巢組和單純運(yùn)動組。以上結(jié)果提示運(yùn)動協(xié)同中藥治療可協(xié)同對抗去卵巢引起的骨量丟失，與既往研究結(jié)果相一致[12]。

雖然絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究者普遍認(rèn)為雌激素分泌下降誘導(dǎo)的骨吸收增加是其主要原因[13]。文獻(xiàn)亦證實(shí)以淫羊藿為主的益骨中藥可有效刺激成骨細(xì)胞分化、抑制破骨細(xì)胞功能[14-15]。本研究通過PCR和Western blot探究Osterix和P-GSK-3β水平的變化，從而驗(yàn)證不同干預(yù)措施的治療效果。去卵巢組Osterix的mRNA水平明顯降低，而運(yùn)動協(xié)同中藥治療組明顯提高；但單純中藥治療和單純運(yùn)動療法與假手術(shù)組相比差異不明顯。結(jié)果說明去卵巢大鼠成骨細(xì)胞功能明顯受到抑制，導(dǎo)致骨重建的失衡，而運(yùn)動協(xié)同中藥治療有效增加Osterix表達(dá)，從而促進(jìn)骨形成。此外，去卵巢組大鼠P-GSK-3β水平顯著上升；各治療組P-GSK-3β水平明顯低于去卵巢組，尤以運(yùn)動協(xié)同中藥治療組水平下降趨勢最為明顯。提示各療法均能抑制去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠股骨組織GSK-3β磷酸化，體現(xiàn)在GSK-3β活性的激活，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin通路。

綜上所述，運(yùn)動聯(lián)合早期中藥治療可對抗去卵巢引起的大鼠體重增加及骨密度降低，具有協(xié)同作用。同時，運(yùn)動聯(lián)合早期中藥治療可促進(jìn)Osterix表達(dá)、降低P-GSK-3β水平，從而促進(jìn)骨形成?？傊?，本研究通過構(gòu)建去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，證實(shí)運(yùn)動聯(lián)合中藥治療具有協(xié)同作用。