李俊雅，李 君

(湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術學院醫(yī)技學院，湖南 湘潭 411102）

腦梗死是由于患者大腦缺血、缺氧所致。腦梗死患者的大腦若長時間缺血可發(fā)生神經(jīng)功能障礙，可對其生命造成威脅。因此，對腦梗死患者采用一種有效、快速的方法恢復其腦缺血區(qū)域的血液供應具有重要意義[1-2]。骨髓間充質干細胞（bone marrow stromal stem cells，BMSCs）可在適宜的條件下分化為神經(jīng)細胞，可用這種干細胞改善腦梗死患者的病情[3-4]。鹽酸托哌酮可直接擴張腦梗死患者血管的平滑肌，抑制其發(fā)生多突觸反射，降低其骨骼肌的張力，進而使其腦部的血流量增加。鹽酸托哌酮是臨床上治療高血壓、心絞痛、短暫性腦缺血及腦梗死等心腦血管疾病的常用藥[5]。有研究資料顯示，對缺血性腦損傷患者采用鹽酸托哌酮聯(lián)合骨髓間充質干細胞移植進行治療的效果很好。在本次研究中，筆者主要探討對缺血性再灌注腦損傷大鼠采用鹽酸托哌酮聯(lián)合骨髓間充質干細胞移植進行治療的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將中南大學湘雅醫(yī)學院實驗動物中心提供的48只健康雄性大鼠作為研究對象。這48只大鼠的年齡均為3～4個月，其體重為250～330 g，其動物合格證號為：SCXK（湘）2015-0412。將這些研究對象隨機分為模型組、干細胞移植組、鹽酸托哌酮組及聯(lián)合治療組，每組各有12只大鼠。四組大鼠的一般資料相比，P＞0.05，具有可比性。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗用的主要儀器與試劑本次實驗使用的主要儀器與試劑包括：血管內(nèi)皮生長因子免疫組化試劑盒（生產(chǎn)廠家：北京博奧森生物技術公司）；氯化三苯基四唑氮（TTC）（生產(chǎn)廠家：廣州威佳科技有限公司）；鹽酸托哌酮片（生產(chǎn)廠家：江蘇中興藥業(yè)有限公司）。

1.2.2 動物模型的制作采用線栓法（Longa）建立大鼠腦缺血性再灌注腦損傷模型（Middle cerebral artery occlusion MCAO）[6-7]。具體建模的方法為：對大鼠進行全麻。結扎大鼠右側近心端的頸總動脈,將其遠心端的頸總動脈夾閉，將其頸總動脈剪一小口，經(jīng)其頸總動脈和頸內(nèi)動脈插入線栓。等待1 h后，在大鼠麻醉的狀態(tài)下完全拔出線栓，并結扎其頸內(nèi)動脈的遠心端。建模成功的標準為[6]：在大鼠蘇醒后，將其尾巴提起，其左側前肢呈內(nèi)收屈曲狀。大鼠向左劃圈爬行，其在站立時向左側傾倒。大鼠的瞳孔縮小、眼瞼下垂、眼裂狹小、眼球內(nèi)陷及患側額部無汗。建模失敗的標準為：大鼠無神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)或完全不能行走。若有需要排除的大鼠，應隨機補足大鼠的數(shù)目。

1.2.3 治療方法對模型組大鼠不使用任何方法進行治療，并讓其自由飲食。在建模24 h后，對干細胞移植組大鼠采用骨髓間充質干細胞移植進行治療。骨髓間充質干細胞移植的方法為：使用大鼠立體定向儀為大鼠注入骨髓間充質干細胞，并讓其自由飲食。在建模24 h后，對鹽酸托哌酮組大鼠使用鹽酸托哌酮進行治療。鹽酸托哌酮的用法為：灌胃，1.5 g/kg，1次/d。在建模24 h后，對聯(lián)合治療組大鼠用鹽酸托哌酮聯(lián)合骨髓間充質干細胞移植進行治療。鹽酸托哌酮的用法與鹽酸托哌酮組大鼠。進行骨髓間充質干細胞移植的方法與干細胞移植組大鼠的使用方法相同。

1.2.4 計算各組大鼠CD34陽性細胞數(shù)的方法采用 CD34多克隆抗體免疫組化染色后，觀察大鼠血管內(nèi)皮細胞中染成棕黃色或淺棕色顆粒的沉著情況，在高倍鏡視野下(×400倍)在其紋狀體區(qū)中隨機選擇5 個不重復的視野，在這5個視野中計算其陽性細胞的總數(shù)，然后將陽性細胞的總數(shù)除以5求得平均數(shù)。

1.2.5 觀察大鼠腦梗死體積的方法將大鼠進行麻醉,從其背面剪下其頭部并取出其大腦,將其大腦沖洗后在-20℃的環(huán)境中快速冷凍30 min。然后，在大鼠腦前極與視交叉連線中點處、漏斗柄與尾極之間, 每隔2 mm做連續(xù)冠狀切片,并將其置于濃度為2%的TTC緩沖液中,在37℃避光水浴孵育20～30 min。正常大鼠的腦組織為深紅色，缺血性再灌注腦損傷大鼠的腦組織不著色。

1.3 觀察指標

在接受治療后的第3 d及第7 d，觀察各組大鼠神經(jīng)功能缺損的評分、CD34陽性細胞數(shù)及腦梗死的體積。根據(jù)文獻[8]介紹的方法，用神經(jīng)功能缺損評分表評估大鼠神經(jīng)功能的缺損程度，評估表的內(nèi)容包括大鼠向患側旋轉、前爪的抓力及爬桿的能力3項。每1項的總評分為4分，評估表的總評分為12分，評分越高表明其神經(jīng)功能缺損的程度越嚴重。

1.4 統(tǒng)計學方法

對本次研究中的數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 接受治療后四組大鼠神經(jīng)功能評分的對比

接受治療后的第3 d及第7 d，與模型組大鼠相比，干細胞移植組大鼠、鹽酸托哌酮組大鼠及聯(lián)合治療組大鼠神經(jīng)功能缺損的評分均較低（P＜0.05）。與接受治療后的第3 d相比，在治療后的第7 d干細胞移植組大鼠、鹽酸托哌酮組大鼠及聯(lián)合治療組大鼠神經(jīng)功能缺損的評分均較低（P＜0.05）。在接受治療后的第3 d及第7 d，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損的評分相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 接受治療后四組大鼠神經(jīng)功能評分的對比(分，±s)

表1 接受治療后四組大鼠神經(jīng)功能評分的對比(分，±s)

*與模型組相比，P＜0.05；#與接受治療的3 d相比，P＜0.05。

組別 例數(shù) 3d 7d模型組 12 9.48±0.66 9.42±1.63干細胞移植組 12 7.48±1.12* 4.35±1.13*#鹽酸托哌酮組 12 7.35±1.04* 4.50±1.31*#聯(lián)合治療組 12 6.18±1.13* 3.02±0.76*#

2.2 接受治療后四組大鼠CD34陽性細胞數(shù)的比較

接受治療后的第3 d及第7 d，與模型組大鼠相比，干細胞移植組大鼠、鹽酸托哌酮組大鼠及聯(lián)合治療組大鼠的CD34陽性細胞數(shù)均較高（P＜0.05）。與接受治療后的第3 d相比，在治療后的第7 d干細胞移植組大鼠、鹽酸托哌酮組大鼠及聯(lián)合治療組大鼠的CD34陽性細胞數(shù)均較高（P＜0.05）。在接受治療后的第3 d及第7 d，模型組大鼠的CD34陽性細胞數(shù)相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表2及圖1～4。

表2 接受治療后四組大鼠CD34陽性細胞數(shù)的比較(個，±s)

表2 接受治療后四組大鼠CD34陽性細胞數(shù)的比較(個，±s)

*與模型組相比，P＜0.05；#與接受治療后3 d相比，P＜0.05。

組別 例數(shù) 3 d 7 d模型組 12 14.88±1.46 15.33±2.01移植組 12 22.02±1.58* 26.82±2.21*鹽酸托哌酮組 12 23.01±2.32* 26.59±1.85*聯(lián)合治療組 12 26.45±2.24* 35.12±1.69*#

圖1 治療后7 d模型組大鼠CD34陽性細胞分布情況

圖2 治療后7 d移植組大鼠CD34陽性細胞分布情況

圖3 治療后7 d鹽酸托哌酮組患者CD34陽性細胞分布情況

圖4 治療后7 d聯(lián)合治療組患者CD34陽性細胞分布情況

2.3 接受治療后四組大鼠腦梗死體積的比較

接受治療后的第3 d及第7 d，與模型組大鼠相比，干細胞移植組大鼠、鹽酸托哌酮組大鼠及聯(lián)合治療組大鼠腦梗死的體積均較?。≒＜0.05）。與接受治療后的第3 d相比，在治療后的第7 d干細胞移植組大鼠、鹽酸托哌酮組大鼠及聯(lián)合治療組大鼠腦梗死的體積均較?。≒＜0.05）。在接受治療后的第3 d及第7 d，模型組大鼠腦梗死的體積相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表3。

表3 接受治療后四組大鼠腦梗死體積的比較(%，±s)

表3 接受治療后四組大鼠腦梗死體積的比較(%，±s)

*與模型組相比，P＜0.05；#與接受治療后3 d相比，P＜0.05。

組別 例數(shù) 3d 7d模型組 12 35.66±1.25 35.69±2.28#移植組 12 30.10±1.27* 19.48±2.21*#鹽酸托哌酮組 12 30.80±0.98* 18.57±0.78*#聯(lián)合治療組 12 26.25±1.30* 12.22±1.07*#

3 討論

患者罹患腦梗死后，其大腦可發(fā)生血管內(nèi)皮損傷及血液循環(huán)減少。使腦部血管再生是對腦梗死患者進行治療的目的之一。腦梗死患者的腦部血管再生后，可保護其腦部缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)元及內(nèi)皮細胞，并清除其壞死的腦組織[9-11]。CD34是臨床上常用的反映血管新生的標志物。該細胞具有誘導患者腦缺血處血管再生的作用[12-14]。有資料顯示，在腦部新生血管內(nèi)皮中CD34的陽性表達大于腦部非新生血管內(nèi)皮中CD34的陽性表達。由此可說明，大腦中CD34陽性細胞數(shù)的增加與血管新生有關[15]。本次研究的結果證實，對缺血性再灌注腦損傷大鼠采用鹽酸托哌酮聯(lián)合骨髓間充質干細胞移植進行治療的效果顯著，可促進其神經(jīng)功能的恢復，減小其腦梗死的體積。