袁玉輝，王舸泓， 董浩然， 宋博文， 劉顯軍

(宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西省作物生長發(fā)育調(diào)控重點實驗室，江西宜春 336000)

芥菜型油菜(Brassicajuncea)屬于十字花科蕓薹屬，具有抗旱、抗裂莢、耐熱、耐貧瘠等特點，在中國西部地區(qū)、印度北部等廣泛種植，在澳大利亞、加拿大、俄羅斯中部、西西伯利亞、波蘭等國家和地區(qū)也有種植，是一種重要的油料作物[1]。近年來，隨著芥菜型油菜基因組序列的陸續(xù)公布[2-3]，芥菜型油菜的基因功能研究開啟了新的時代。WRKY轉(zhuǎn)錄因子由于具有一個高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域而得名[4]，是植物中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子家族。WRKY結(jié)構(gòu)域具有60個左右氨基酸，包括保守的WRKYGQK氨基酸和C末端具有1個鋅指結(jié)構(gòu)，鋅指結(jié)構(gòu)又具有2種類型CX4-5CX22-23HXH(C2H2)和CX7CX23HXC(C2HC)。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)的特征，WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為三類：第一類包括2個WRKY核心結(jié)構(gòu)域和1個鋅指結(jié)構(gòu)C2H2，第二類包括1個WRKY核心結(jié)構(gòu)域和1個鋅指結(jié)構(gòu)C2H2，第三類包括1個WRKY核心結(jié)構(gòu)域和1個鋅指結(jié)構(gòu)C2HC[5]。大量研究表明，WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子參與了植物的多種生理過程，如植物形態(tài)形成、器官衰老、物質(zhì)代謝調(diào)控以及生物脅迫和非生物脅迫過程等等[6-8]。Wei等[9]克隆并分析了天藍遏藍菜的TcWRKY53，該基因同時受冷害、鹽害和滲透脅迫的誘導(dǎo)表達；Jing等[10]分析了獼猴桃WRKY家族的基因，發(fā)現(xiàn)AcWRKY38、AcWRKY40、AcWRKY95、AcWRKY96對干旱和鹽脅迫都有不同程度的響應(yīng)；Xiao等[11]研究棕櫚的WRKY基因家族功能發(fā)現(xiàn)，EgWRKY06、EgWRKY11、EgWRKY25、EgWRKY61、EgWRKY72和EgWRKY88等基因在冷害、干旱和鹽脅迫下誘導(dǎo)差異表達。在擬南芥中研究表明，AtWRKY71調(diào)控植株株型形成、花期調(diào)控以及非生物脅迫[12-14]；Qin等[15]研究發(fā)現(xiàn)小麥通過TaWRKY71-1基因表達促進IAA向MeIAA的轉(zhuǎn)化來改變生長素內(nèi)在水平，調(diào)控下胚葉發(fā)育；鄒克琴等[16]對水稻W(wǎng)RKY71研究發(fā)現(xiàn)，該基因與病害的抗性相關(guān)，但在油菜中WRKY71基因家族功能鮮見報道。

芥菜型油菜基因組序列雖已經(jīng)公布[2]，關(guān)于芥菜型油菜WRKY71家族基因成員的研究未見報道。本研究利用芥菜型油菜‘紫葉芥’的基因組概覽測序[17](genome survey sequencing, GSS) 序列中WRKY71基因家族序列設(shè)計簡并引物，通過RT-PCR 技術(shù)獲得芥菜型油菜WRKY71基因家族4個基因的完整序列，并采用實時熒光定量PCR技術(shù)研究該基因家族在不同脅迫條件下葉中的表達情況，為進一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以芥菜型油菜‘紫葉芥’為試驗材料，于2017年9月種植于江西省作物生長發(fā)育調(diào)控重點實驗室科研溫室內(nèi)，培養(yǎng)條件為溫度28 ℃/18 ℃，光照16 h/8 h(白天/黑夜)。生長3周后，選生長健壯的苗，進行低溫(4 ℃)、激素(100 mol/L ABA)以及鹽(200 mmol/L NaCl)脅迫處理。處理后0、1、3、6、12和24 h分別采集葉片組織，相同的材料重復(fù)取樣3次，用液氮速凍后放置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1RNA提取與BjuWRKY71s基因克隆芥菜型油菜葉片的總RNA提取參照TaKaRa公司的RNAiso plus產(chǎn)品說明書進行，RNA樣品濃度由英國Biodrop uLITE分光光度計測定。cDNA第一鏈的合成參照TaKaRa公司的PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA合成試劑盒產(chǎn)品說明書進行。通過對芥菜型油菜GSS序列的檢索，獲得擬南芥AtWRKY71的同源序列。利用Primer 5.0設(shè)計簡并引物(表1)，以芥菜型油菜葉cDNA為模板進行PCR擴增獲，得BjuWRKY71s基因序列。擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火35 s，72 ℃延伸50 s，36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測；參照OMEGA瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒說明書對目的片段回收；采用pMD18-T載體連接回收產(chǎn)物；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受細胞培養(yǎng)14～16 h；每對簡并引物利用PCR鑒定8個陽性菌落送上海鉑尚生物有限公司測序。

表1 引物序列

1.2.2芥菜型油菜WRKY71s的生物信息學(xué)分析通過DNAMAN6.0處理獲得的芥菜型油菜WRKY71s序列，將其翻譯成氨基酸序列，利用在線網(wǎng)站分析和預(yù)測BjuWRKY71s轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)及功能。氨基酸理化性質(zhì)的分析采用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)，氨基酸序列的親疏水性分析采用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)，蛋白質(zhì)磷酸化位點的分析采用NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)，蛋白質(zhì)二維結(jié)構(gòu)的預(yù)測采用SPOMA(http://npsapbil.ibcp.fr/cgibin/ npsa_automat.pl? page=/NPSA/npsa_sopma.html)，使用同源模型軟件SWISS-MODEL預(yù)測其三維結(jié)構(gòu)。利用TargetP 1.1 Sever(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TargetP/)進行BjuWRKY71s蛋白的亞細胞定位預(yù)測；使用Conserved Domains進行保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測；使用Protfun預(yù)測其功能分類(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)；利用軟件MEGA5.1采用N-J 法構(gòu)建基因的進化樹。

1.2.3芥菜型油菜WRKY71s基因的表達分析芥菜型油菜不同處理葉片的總RNA提取參照TaKaRa公司的RNAiso plus產(chǎn)品說明書進行，反轉(zhuǎn)錄按照TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒的說明書操作。使用Primer Primer 5.0設(shè)計實時定量引物(表1)，由上海生工合成，引物序列見表1。采用ABI StepOnePlus實時定量系統(tǒng)進行芥菜型油菜BjuWRKY71s基因表達分析，使用TaKaRa公司的SYBR?PremixExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)試劑盒。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共計40個循環(huán)。設(shè)置3個重復(fù)。采用2-ΔΔCt方法分析基因相對表達量。

2 結(jié)果分析

2.1 芥菜型油菜WRKY71s基因的克隆和染色體定位

根據(jù)芥菜型油菜的GSS序列設(shè)計2對簡并引物，以芥菜型油菜葉的cDNA為模板，引物BjW71-1擴增結(jié)果約840 bp左右(圖1)，PCR產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化，陽性克隆測序后獲得2個大小分別為822和840 bp擴增產(chǎn)物，分別編碼273和279個氨基酸，并將其分別命名為BjuWRKY71-1和BjuWRKY71-2(圖2)；引物BjW71-2擴增結(jié)果約840 bp左右(圖1)，PCR產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化陽性克隆，測序后獲得2個大小分別為834和855 bp擴增產(chǎn)物，分別編碼277和284個氨基酸，并將其分別命名為BjuWRKY71-3和BjuWRKY71-4(圖2)。將克隆的BjuWRKY71s基因與公布的芥菜型油菜基因組序列進行Blast比對，4個BjuWRKY71s基因家族成員分布在3條染色體和1條scaffold上，分別為染色體A09、B04、A07和scaffold 144(表2)。

1．DL2000；2.引物BjW71-1；3.引物BjW71-2 圖1 芥菜型油菜WRKY71s基因家族擴增產(chǎn)物1．DL2000；2. Primer BjW71-1；3. Primer BjW71-2Fig.1 PCR products of WRKY71s gene in B.juncea

2.2 芥菜型油菜WRKY71s基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

利用 ProtParam 預(yù)測分析 4個BjuWRKY71s蛋白的基本理化性質(zhì)(表3)，這些蛋白的分子量為27.11～32.18 kD， 理論等電點為 7.75～9.08，負電荷的氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為 26～32， 正電荷的氨基酸殘基數(shù) (Arg+Lys) 為 32～35， 脂肪系數(shù)為 51.31～59.75，不穩(wěn)定系數(shù)為 36.69～63.71，總平均親水性為 0.833～0.969，均為親水性不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。SOPMA 在線預(yù)測分析(表4)表明，這4個蛋白的二級結(jié)構(gòu)從多到少依次都是無規(guī)則卷曲、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和延伸直鏈。其中無規(guī)則卷曲超過46.13%，是這4個BjuWRKY71s蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要組成部分。亞細胞都定位于細胞核上(表4)。

2.3 芥菜型油菜WRKY71s基因同源進化分析

將BjuWRKY71-1s的氨基酸序列在NCBI上做Blast序列比對分析，選取10個E值較高物種的序列，運用DNAMAN軟件進行同源比較。結(jié)果(圖2)表明，BjuWRKY71s基因家族的氨基酸與選取的10個物種氨基酸序列的保守區(qū)主要集中在WRKY結(jié)構(gòu)域。利用Mega5.0軟件對BjuWRKY71s基因與上述基因進化關(guān)系進行比較，BjuWRKY71s基因與白菜的親緣關(guān)系最近(圖3)。

表2 芥菜型油菜WRKY71s基因序列信息

表3 芥菜型油菜WRKY71s蛋白理化性質(zhì)

表4 芥菜型油菜WRKY71s蛋白二級結(jié)構(gòu)和亞細胞定位的預(yù)測

BrWRKY71. 白菜(NP_001288945.1)；EgWRKY71. 油棕(XP_010930927.1)；GhWRKY71. 陸地棉(AIE43914.1)；OsWRKY71. 水稻(AAT84158.1)；RcWRKY71.蓖麻(XP_025012488.1)；SbWRKY71. 高粱(XP_002451666.1)；SiWRKY71. 谷子(XP_004951681.1)；TaWRKY71. 小麥(ABN43177.1)；VaWRKY71. 山葡萄(AFK27602.1)；ZmWRKY71. 玉米(XP_008657117.1)；黑框部分為WRKY結(jié)構(gòu)域圖2 WRKY71s氨基酸多序列比對BrWRKY71. Brassica rapa(NP_001288945.1); EgWRKY71. Elaeis guineensis(XP_010930927.1); GhWRKY71. Gossypium hirsutum(AIE43914.1); OsWRKY71. Oryza sativa(AAT84158.1); RcWRKY71. Ricinus communis(XP_025012488.1); SbWRKY71. Sorghum bicolor(XP_002451666.1); SiWRKY71. Setaria italica(XP_004951681.1); TaWRKY71. Triticum aestivum(ABN43177.1); VaWRKY71. Vitis amurensis(AFK27602.1); ZmWRKY71. Zea mays(XP_008657117.1); WRKY domains are shaded in black frameFig.2 Amino acid sequence multiple protein sequence alignment of WRKY71s

2.4 芥菜型油菜WRKY71s基因脅迫表達分析

利用qRT-PCR分析芥菜型油菜WRKY71s基因家族在各種非生物逆境脅迫下的表達。圖4顯示，在200 mmol·L-1NaCl處理下，芥菜型油菜WRKY71s基因家族4個基因均受到誘導(dǎo)表達，BjuWRKY71-1、BjuWRKY71-2和BjuWRKY71-4這3個基因的表達模式相似，基因表達量隨處理時間延長逐步升高，在6 h表達量最大(分別是對照表達量的15.7倍、4.2倍和90.3倍)，然后再降低；而BjuWRKY71-3在高鹽誘導(dǎo)0～24 h逐步增高，到24 h是對照的9.2倍。

圖3 芥菜型油菜WKRY71s與其他植物的WKRY71轉(zhuǎn)錄因子進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of BjuWRKY71s and WRKY71 transcription factors of other plants

由圖5可知，在4 ℃低溫處理后，芥菜型油菜WRKY71s家族基因受低溫誘導(dǎo)24 h后都上調(diào)表達。BjuWRKY71-1、BjuWRKY71-2和BjuWRKY71-3這3個基因呈現(xiàn)先上調(diào)后下降，再上調(diào)的表達模式，且在24 h表達量最大；BjuWRKY71-4表現(xiàn)為先下降后上調(diào)，且24 h表達量是對照的36.6倍。

由圖6可知，用100 mol/L ABA處理1 h后，BjuWRKY71-1和BjuWRKY71-2基因表達量先下降然后逐漸上調(diào)，在6 h時達到最大值，分別是對照的12.0和2.9倍，隨后又下降，到24 h時它們的表達量僅為對照的0.4和0.1倍；而BjuWRKY71-3和BjuWRKY71-4基因在ABA處理后先表達上調(diào)，在6 h時表達量最大，分別是對照的6.3和70.5倍，隨后相對表達量逐步降低。

不同小寫字母表示顯著差異水平(P<0.05)，下同圖4 芥菜型油菜WRKY71s基因家族在鹽脅迫下的表達The normal letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as belowFig.4 Expression of BjuWRKY71s in response to salt stress

圖5 芥菜型油菜WRKY71s基因家族在低溫脅迫下的表達模式Fig.5 Expression of BjuWRKY71s under low temperature stress

圖6 芥菜型油菜WRKY71s基因家族在ABA脅迫下的表達模式Fig.6 Expression of BjuWRKY71s in response to ABA stress

3 討 論

過去20多年大量研究結(jié)果表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子對植物形態(tài)形成、種子發(fā)育、種子休眠和萌發(fā)、物質(zhì)代謝以及生物脅迫和非生物脅迫過程的調(diào)控起著重要作用[18]。在擬南芥、小麥和水稻中已有報道，WRKY71基因家族調(diào)控植物株型形成、葉的發(fā)育、花期調(diào)控以及病害的抗性和非生物脅迫等[12-16]。但在油菜中，WRKY71基因家族基因結(jié)構(gòu)鑒定和功能研究未有報道。

本研究利用生物信息學(xué)方法從芥菜型油菜的GSS序列中分離了4個WRKY71s基因，并通過RT-PCR方法確定了4個拷貝序列，其編碼的蛋白長度各異，均具有典型的WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域保守氨基酸序列WRKYGQK，屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族。從蛋白理化性質(zhì)預(yù)測來看，4個芥菜型油菜WRKY71s 蛋白都為偏酸性, 且都屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白，這些相似的理化性質(zhì)預(yù)示4個芥菜型油菜WRKY71s 蛋白間可能存在某些相似的功能。亞細胞定位結(jié)果表明4個芥菜型油菜的WRKY71s位于細胞核中，與水稻和葡萄的WRKY71轉(zhuǎn)錄因子定位結(jié)果一致，推測它們在細胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能[16,19]。芥菜型油菜是異源四倍體， A和B染色體上的基因存在高度同源性[2]，BjuWRKY71-1和BjuWRKY71-3這2個拷貝位于A染色體，BjuWRKY71-2位于B染色體，BjuWRKY71-4推測可能位于B染色體上，具體位置有待進一步研究。

為了研究芥菜型油菜WRKY71s基因家族在非生物脅迫下的反應(yīng)，本試驗采用鹽(NaCl)、激素(ABA)、低溫(4 ℃)對芥菜型油菜‘紫葉芥’進行處理，利用qRT-PCR分析檢測了4個BjuWRKY71s轉(zhuǎn)錄因子的相對表達量，結(jié)果表明，芥菜型油菜WRKY71s家族基因在不同的處理作用下有不同的作用模式。在鹽處理后，BjuWRKY71-1 、BjuWRKY71-2和BjuWRKY71-4這3個基因表達量先逐漸升高，在6 h表達量最大，然后降低，這與AtWRKY40同源的基因BnD11在油菜抗旱性品種“862”受到鹽脅迫后的表型一致[20]，而BjuWRKY71-3在高鹽誘導(dǎo)下0～24 h逐步增高。在4 ℃低溫處理后，芥菜型油菜WRKY71家族基因受低溫誘導(dǎo)24 h后都上調(diào)表達，BjuWRKY71-4基因上調(diào)的倍數(shù)最為顯著，這與Kim等[21]對水稻OsWRKY71基因功能研究結(jié)果一致，推測BjuWRKY71s也可能通過調(diào)節(jié)下游靶基因在耐冷過程中起正向調(diào)節(jié)作用。ABA處理后，BjuWRKY71s基因表達先上調(diào)，在6 h時達到最大值，隨后又下調(diào)表達逐步降低。在擬南芥中AtWRKY71受ABA處理后在0～12 h逐步上調(diào)表達與BjuWRKY71-3、BjuWRKY71-4在0～12 h表現(xiàn)基本一致[18]。4個BjuWRKY71s在非生物脅迫下都有不同的響應(yīng)，BjuWRKY71-4在本研究的3個脅迫條件下響應(yīng)最為敏感，可能在不同非生物脅迫下起重要的作用。

本研究利用芥菜型油菜GSS序列中分離出的BjuWRKY71s基因序列設(shè)計引物克隆，并定位了該基因在芥菜型油菜的染色體位置，利用生物信息學(xué)分析該基因家族的結(jié)構(gòu)、進化和系統(tǒng)發(fā)生，并利用qPCR對該基因家族的基因在葉中對非生物脅迫響應(yīng)表達做了分析，為進一步深入研究BjuWRKY71基因家族的功能奠定了基礎(chǔ)。