郝向陽，孫雪麗，劉 范，項蕾蕾，王天池，賴鐘雄，程春振

(福建農(nóng)林大學 園藝植物生物工程研究所，園藝學院，福州 350002)

過氧化物酶(Peroxidase，POD，EC 1.11.1.X)是一類普遍存在于動植物和微生物中的氧化酶。植物中存在Class Ⅰ和Ⅲ兩類POD，其中Class Ⅲ POD(PRX，EC 1.11.1.7)為植物所特有[1-2]。PRX由一個多基因家族編碼，在擬南芥中該基因家族有73個成員，而水稻有138個成員[3-5]。此類POD參與植物體內(nèi)的過氧自由基和H2O2平衡的維持[6-7]，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[8]。此外，POD還參與木質(zhì)素合成[9-10]、活性氧代謝[11]、激素調(diào)控[12]及其他脅迫應答[13-16]。如：在低溫和干旱脅迫下，煙草POD活性均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢[17]，說明POD參與了煙草低溫和干旱脅迫的響應；李國旗等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，楊樹形成層POD活性除了與耐鹽性有關外還與其所處的生長周期有關。

植物被病原菌侵染后，能迅速產(chǎn)生大量的ROS來抵御病原菌的入侵或殺死病原菌，但過量的ROS會損害細胞甚至導致細胞凋亡。POD能夠清除植物體內(nèi)活性氧，在植物抗病過程中也發(fā)揮著重要作用[19-20]。蘇亞春等[21]的研究表明甘蔗ScPOD02基因在抗病品種中受黑穗病菌誘導顯著，在中感及感病品種中不變或略微下調(diào)表達。Zhang等[22]在玉米上也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象：在黑穗病菌侵染后，抗病品種中POD基因上調(diào)表達，而在感病品種中下調(diào)表達，說明POD基因的表達水平與植物抗病性相關。

鑒于POD在植物抗逆防御反應中的重要作用，科學家們對POD基因及其編碼的蛋白展開了大量研究。非洲菊(GerberajamesoniiBolus)是世界五大鮮切花之一，具有極高的經(jīng)濟價值[23]。目前有關非洲菊POD基因及其編碼蛋白的研究較少。本研究中，從實驗室前期獲得的非洲菊轉錄組中篩選獲得4條包含完整ORF的POD基因序列，對它們進行了克隆及生物信息分析，同時還研究了不同脅迫處理下這些基因和POD活性的變化特征，為揭示非洲菊POD基因的功能以及今后它們在非洲菊抗性育種中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗用非洲菊‘玲瓏’植株由福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所和三明市農(nóng)業(yè)科學研究院提供。

(1)器官取樣：取非洲菊根、葉柄和葉片，備用。

(2)水楊酸處理：用100 μmol/L水楊酸(SA)噴灑非洲菊葉片至葉片滴水，并于處理后0、4、8 、12和24 h取葉片。

(3)PEG處理：用30%聚乙二醇(PEG)溶液一次性澆透土壤，并于處理后0、1、2 、3和6 h取葉片。

(4)低溫處理：將非洲菊植株置于4 ℃光照培養(yǎng)箱中，分別于處理后0、4、8和12 h取葉片。

(5)根腐病菌接種：從28 ℃暗培養(yǎng)5 d的隱地疫霉菌落邊緣挑取直徑為0.5 mm菌塊置于100 mL PDB培養(yǎng)基中，28 ℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，稀釋3倍后備用。將非洲菊根部輕輕劃傷后置于隱地疫霉菌液中2 h，移栽，并于處理后0、2 、4 和6 d取根系。

所有樣品取樣后立即置于液氮中速凍，之后置于-80 ℃超低溫冰箱中，用于后續(xù)RNA提取及POD活性測定。

1.2 方 法

1.2.1酶活測定POD催化H2O2氧化特定底物，其產(chǎn)物在470 nm有特征光吸收，采用分光光度法，利用植物過氧化物酶試劑盒(購自蘇州科銘生物技術有限公司)測定不同處理樣品中POD活性。

1.2.2RNA提取及cDNA合成利用Trizol RNA提取試劑盒(TaKaRa)提取非洲菊總RNA。采用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈用于POD基因cDNA的克隆。同時采用 TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal)試劑盒(全式金)逆轉錄合成不同處理樣品的cDNA用于qRT-PCR試驗。所有步驟均參照試劑盒說明書進行。

1.2.3POD基因克隆及測序驗證PCR 反應體系(25 μL)：Dream TaqTMGreen PCR Master Mix (2×) 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL。所用引物序列見表1。PCR 擴增程序為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ～59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。采用Gel/PCR Extraction Kit回收目的片段，連接pMD 18-T載體后轉化DH5α感受態(tài)，經(jīng)菌液PCR鑒定后選取陽性克隆子送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序驗證。

1.2.4POD基因及蛋白生物信息學分析采用在線軟件對POD基因及其編碼蛋白進行基本理化性質(zhì)分析(ExPASy，http://web.expasy.org/ protparam/)、信號肽鑒定(SignalP 4.1 Server，http://www.cbs. dtu.dk/ services/SignalP/)、亞細胞定位預測(CELLO:S，http://cello.life.nctu.edu.tw/)、跨膜結構預測(TMpred，http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED _form.html)、磷酸化位點預測(NetPhos 3.1 Server，http://www.cbs.dtu. dk/services/NetPhos/)、保守結構域分析(NCBI Conserved Domain Search，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi)、蛋白質(zhì)二級結構預測(PSIPRED，http://bioinf.cs.ucl.ac. uk/psipred/)。從TAIR(https://www.arabidopsis.org/)中下載擬南芥POD蛋白序列，采用MEGA5.2.2鄰近歸并法(Neighbor-joining method)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5非洲菊POD基因表達分析以非洲菊18SrRNA為內(nèi)參基因進行qRT-PCR試驗。將不同cDNA樣品等體積混樣，隨后按1、0.2、0.04、0.08、0.001 6倍進行梯度稀釋用于繪制標準曲線。以稀釋50倍的cDNA為模板，采用Roche Lightcycler 480熒光定量PCR儀進行相對表達分析。qRT-PCR擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)。qRT-PCR反應體系為SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)熒光染料 10 μL，ddH2O 7.4 μL，上下游引物各0.8 μL，模板1 μL。試驗所用引物序列及相關信息見表1。采用Excel2003和SPSS17.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和差異顯著性分析。

表1 實驗所用引物信息

2 結果與分析

2.1 POD基因克隆及序列分析

在非洲菊轉錄組中查找獲得4條具有完整ORF的POD基因序列，使用特異性引物(表1)進行PCR擴增，獲得了1 000～1 200 bp PCR產(chǎn)物(圖1)。NCBI Blastn比對發(fā)現(xiàn)：4個非洲菊POD基因分別與萵苣(Lactucasativa)POD4、向日葵(Helianthusannuus)POD5、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)POD7、向日葵POD42相似度最高，相似度分別為79%、76%、73%和88%。根據(jù)比對結果將它們分別命名為GjPOD4、GjPOD5、GjPOD7和GjPOD42，GenBank登錄號分別為MH708528、MH708531、MH708529和MH708530。它們的CDS分別為975 、966 、966 和1 005 bp，預測可分別編碼324、321、321和334個氨基酸。4個GjPOD基因起始密碼子均為ATG，GjPOD42和GjPOD5終止密碼子為TAA，GjPOD7和GjPOD4的終止密碼子為TGA。

M.DL2000；1～4分別代表GjPOD5、GjPOD4、GjPOD42和GjPOD7圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖M.DL2000； 1-4 represent GjPOD5, GjPOD4, GjPOD42 and GjPOD7, respectivelyFig.1 Electrophoresis result of PCR products

2.2 生物信息學分析結果

2.2.1GjPOD蛋白基本理化性質(zhì)分析結果蛋白理化性質(zhì)分析顯示，4個非洲菊POD蛋白均屬于不穩(wěn)定堿性蛋白，除GjPOD5外，均為親水蛋白(表2)。GjPOD4中絲氨酸(Ser)含量最高，達12%，其次是丙氨酸(Ala)為9.9%；GjPOD5中亮氨酸(Leu)和丙氨酸(Ala)含量最高，均為11.2%，其次是絲氨酸(Ser)9.3%；GjPOD7絲氨酸(Ser)含量高達12.8%，其次是丙氨酸(Ala)，為9.3%；而GjPOD42中亮氨酸含量最高，達10.5%，其次是絲氨酸(Ser)，為7.2%。

2.2.2亞細胞定位及保守結構域分析結果亞細胞定位預測結果顯示GjPOD4主要定位于葉綠體和胞外區(qū)，GjPOD5定位于液泡，GjPOD7主要定位于胞外區(qū)，GjPOD42主要定位細胞質(zhì)。

保守結構域和結合位點預測發(fā)現(xiàn)，POD蛋白均含有完整的保守結構域(圖2)，含有血紅結合位點、活性位點、底物結合位點和鈣離子結合位點，屬于植物亞鐵紅素依賴Ⅲ型過氧化物酶超家族成員。Motif預測結果顯示4個GjPOD含有5個相同的Motif(圖3)。

2.2.3信號肽、跨膜結構域磷酸化修飾位點分析結果經(jīng)信號肽預測發(fā)現(xiàn)4個POD在N端的1～26個氨基酸內(nèi)含有信號肽。TMpred分析發(fā)現(xiàn)POD均含有由內(nèi)向外和由外向內(nèi)的跨膜螺旋結構。磷酸化修飾位點分析結果顯示：GjPOD7含有磷酸化位點數(shù)最多，為40個，其次是GjPOD4和GjPOD42，分別為36和35個，而GjPOD5磷酸化位點最少，為22個(表3)。

2.2.4GjPOD蛋白質(zhì)二級結構分析結果通過預測POD二級結構發(fā)現(xiàn)4個POD蛋白含有較多的α-螺旋和無規(guī)則卷曲。GjPOD4含有38.89%的α-螺旋和41.61%無規(guī)則卷曲，僅含有4.63%的β-折疊，其余14.81%為延伸片段；GjPOD5的α-螺旋的含量最高，為41.12%，無規(guī)則卷曲為38.32%，β-折疊和延伸片段分別為4.98%和15.58%；GjPOD7的α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-折疊和延伸片段分別為38.32%、40.19%、5.30%和16.2%；GjPOD42的α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸片段和β-折疊分別為40.42%、38.32%、15.2%和5.99%。

表2 4個GjPOD蛋白基本理化性質(zhì)分析結果

下劃線和紅框分別表示保守結構域和血紅素結合位點圖2 多重氨基酸序列比對The underlined characters and the characters in the red box represent the secretory peroxidase conserved domain and heme binding site of POD, respectivelyFig.2 Multiple alignment of the amino acid sequences

圖3 POD保守結構域和motif分析Fig.3 Aanlysis result of the identified conserved domains and motifs in POD proteins

蛋白Protein長度Length/aa信號肽Signal site跨膜結構域Transmembrane domain磷酸化修飾位點Phosphorylation site內(nèi)→外Inside→Outside外→內(nèi)Outside→InsideSTYGjPOD43241～26232862GjPOD53211～21421471GjPOD73211～242124124GjPOD423341～213319124

2.2.5聚類分析結果系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果表明：發(fā)現(xiàn)除AtPRX12和19外，大致分為5組，與擬南芥POD基因家族進化樹結果類似[3](圖4)。非洲菊4條POD并未聚在一起，GjPOD4和GjPOD7與擬南芥AtPRX52聚為一類，GjPOD5與擬南芥AtPRX47聚為一類，屬于Group4，GjPOD42與擬南芥AtPRX42聚為一類，屬于Group1(圖4)。

2.3 不同器官及不同處理下POD活性及POD基因表達差異

2.3.1不同器官中POD活性及POD基因表達差異通過測定不同器官中POD活性發(fā)現(xiàn)：非洲菊葉片中POD活性最高，根和葉柄中活性相差不大(圖5，A)，但未達到顯著水平。

基因表達分析結果(圖5，B)顯示：GjPOD4在根和葉柄中的表達量極顯著低于葉片(P< 0.01)，分別約為葉片的50%和10%；GjPOD5在根中的表達量顯著高于葉片(P< 0.05)；GjPOD7在根中的表達量最高，其次是葉片，葉柄最低；GjPOD42在根中和葉柄中的表達量極顯著低于葉片(P< 0.01)，僅約為葉片的10%。

At. 擬南芥；Gj. 非洲菊；紅色代表GjPODs；Group1～Group5表示5組主要的PODs圖4 POD系統(tǒng)發(fā)育樹At. Arabidopsis thaliana, Gj. Gerbera jamesonii Bolus; Characters in red present represent the gjPODs; Group1-Group5 represent the five major POD groupsFig.4 Phylogenetic tree of PODs

*和**分別表示0.05和0.01水平顯著性差異，下同.圖5 不同組織器官中POD活性(A)以及基因表達(B)* and ** indicate significant difference at the 0.05 and 0.01 levels, respectively. The same as belowFig.5 The POD activities(A) and POD expression patterns(B) in different organs of gerbera

相關性分析結果(表4)顯示：在不同器官中GjPOD42基因的表達與POD活性呈顯著正相關(P< 0.05)，GjPOD4基因的表達與POD活性有一定的正相關性，但未達到顯著水平；GjPOD5和GjPOD7的表達與POD活性呈負相關，但也未達到顯著水平(表4)。

2.3.2非生物脅迫下POD活性及POD基因表達差異在SA處理過程中，POD活性呈現(xiàn)出“升-降-升”的變化趨勢，在4 h時活性最高，約為對照的2.5倍(圖6，A)。4個基因的表達也均呈現(xiàn)“先升后降”的變化趨勢(圖6，B)，其中GjPOD4變化最明顯，在4 h時表達量迅速升高，為對照組的30倍，8 h表達量為對照的23倍，之后雖有所下降但仍高于對照。GjPOD5表達量在SA處理4 h后極顯著低于對照。GjPOD7與GjPOD42的表達水平在SA處理8 h達到最高，約為對照組的2倍，之后則極顯著低于對照。相關性分析結果(表4)表明：在SA處理下，4個GjPOD基因表達水平與POD活性間不存在顯著相關性，而GjPOD7與GjPOD42的表達水平間存在極顯著正相關(P< 0.01)。

使用PEG處理模擬干旱脅迫，結果顯示：在PEG處理條件下，POD活性呈現(xiàn)出“先升后降”的變化趨勢，且均高于對照，并在3 h達到峰值，約為對照的2倍(圖6，A)。GjPOD4基因的表達在1 h變化不大，在2 和6 h顯著上調(diào)(約為對照的3倍)；GjPOD5基因的表達量在PEG處理早期(1 h)和6 h時極顯著低于對照，而在2和3 h極顯著高于對照；GjPOD7與GjPOD42的表達量在3 h時極顯著高于對照(圖6，D)。相關性分析結果(表4)顯示：在PEG處理條件下，POD基因的表達與活性無顯著相關性，而GjPOD7與GjPOD42的表達水平間存在極顯著正相關(P< 0.01)，GjPOD4與GjPOD7、GjPOD4與GjPOD42的表達水平間存在一定負相關性。

表4 POD活性與POD表達水平相關性分析

注：* 表示在0.05水平上(雙側)顯著相關，**表示在0.01水平上顯著相關

Note: * indicates significant correlation at the 0.05 level (bilateral), ** indicate significant correlation at the 0.01 level

A.不同處理；B.水楊酸處理；C.低溫(4 ℃)脅迫；D.PEG干旱處理；E.病原菌處理圖6 不同處理下POD活性(A)及其GjPOD基因(B～E)表達情況A. The different treatments；B. SA treatment；C. Cold(4 ℃)stress；D. PEG treatments；E. Pathogen treatmentFig.6 The POD activities (A) and GjPOD gene expression patterns (B-E) under different treatments

在4 ℃低溫處理下，非洲菊葉片POD活性呈“升-降-升”的變化趨勢，且均高于對照，在12 h時活性達到最高，為對照組的3倍(圖6，A)。GjPOD4基因的表達呈現(xiàn)“升-降-升”的變化趨勢，在低溫處理8 h時顯著低于對照；而低溫處理卻極顯著抑制GjPOD5、GjPOD7和GjPOD42基因的表達，在12 h時的表達量相對于對照分別下降了2倍、11倍和11倍，但GjPOD5在12 h上調(diào)表達(圖6，C)。相關性分析結果(表4)表明：POD基因的表達與POD活性間不存在顯著相關性，而GjPOD5與GjPOD7、GjPOD5與GjPOD42的表達水平間存在顯著正相關(P< 0.05)，GjPOD7與GjPOD42的表達水平間存在極顯著正相關(P< 0.01)。

2.3.3隱地疫霉處理對非洲菊POD活性及POD基因表達的影響接種隱地疫霉2 d后，非洲菊植株葉片出現(xiàn)輕微失水的現(xiàn)象，而此時根系中POD活性迅速升高，約為對照的2倍，之后活性開始下降但仍高于對照(圖6，A)。GjPOD4、GjPOD7和GjPOD42的表達在響應根腐病的過程中均呈現(xiàn)“先升后降”的變化趨勢，在4 d時表達量最高，分別約為對照的3倍、3倍和4倍，為2 d時的1.84倍、1.06 倍和1.2倍；而GjPOD5則呈現(xiàn)出“升-降-升”的變化趨勢，2 d時的表達量最高，約為對照組的2倍，且存在極顯著差異(P< 0.01)，4 d時的表達量低于對照組，6 d時的表達量略高于對照組(圖6，E)。相關性分析結果(表4)表明：在隱地疫霉處理條件下，4個基因的表達與活性雖未達到顯著水平，但均呈一定的正相關性，而GjPOD7與GjPOD42的表達水平間存在顯著正相關(P< 0.05)，GjPOD4與GjPOD5的表達水平間存在一定的負相關。

3 討 論

POD是植物抗氧化系統(tǒng)中的關鍵酶之一。本研究基于非洲菊轉錄組結果，篩選獲得4個具有完整CDS的POD基因(GjPOD4、GjPOD5、GjPOD7和GjPOD42)，并利用RT-PCR技術從‘玲瓏’非洲菊中克隆獲得這些基因cDNA序列。蛋白序列分析結果表明這4個POD基因所編碼的蛋白均屬于植物亞鐵紅素依賴Ⅲ型過氧化物酶超家族成員。通過對這些基因進行生物信息學和表達分析，同時結合POD活性，發(fā)現(xiàn)GjPOD廣泛參與非洲菊抗逆防御反應，此外本研究還發(fā)現(xiàn)這4個GjPOD基因存在一定的功能冗余但也有所差異。

3.1 GjPOD基因廣泛參與非洲菊抗逆防御反應

Class Ⅲ POD為植物所特有，包含多種同工酶和基因結構，其功能多樣性，能夠廣泛參與植物體內(nèi)多種代謝活動。

POD基因不僅可以被植物激素調(diào)節(jié)，也可以被干旱等多種非生物脅迫調(diào)節(jié)，在植物抗逆防御反應過程中也同樣發(fā)揮著重要作用[5, 24-25]。過表達APX基因可以增加紅藻的耐熱性、提高低溫下煙草種子的萌發(fā)率、增強轉基因煙草的耐寒性、提高水稻孕穗期的耐寒性和結實率[26-28]。本研究中的研究發(fā)現(xiàn)在低溫、干旱(PEG模擬)條件下GjPOD基因均會出現(xiàn)差異表達，暗示它們在非洲菊抵御非生物脅迫反應中發(fā)揮著作用。

POD在植物抗病過程中的重要作用已在多個物種中得到驗證[21-22, 25, 29-30]。Hilaier等[29]發(fā)現(xiàn)水稻葉片感染白葉枯病菌后OsPRX114上調(diào)表達；Choi等[25]發(fā)現(xiàn)辣椒在響應病原菌入侵的過程中，CaP02基因能夠參與調(diào)控H2O2水平，并且H2O2水平與編碼病原相關蛋白基因的表達密切相關。本研究中，GjPOD4、GjPOD7和GjPOD42的表達在各個時間點均受根腐病菌侵染誘導顯著，而GjPOD5在感病初期(2 d)也極顯著上調(diào)，說明它們在非洲菊響應根腐病菌入侵的過程中發(fā)揮著重要作用。

3.2 GjPOD5、GjPOD7和GjPOD42間可能存在一定的功能冗余

通過分析非洲菊4條POD基因編碼蛋白序列，發(fā)現(xiàn)它們擁有相同的保守結構域和motif，暗示它們的功能和作用方式可能比較相似。基因表達分析發(fā)現(xiàn)，這些基因尤其是GjPOD5、GjPOD7和GjPOD42在不同處理下的變化趨勢大致相同。此外，相關性分析結果也表明它們的表達水平在各種處理下多存在顯著或極顯著正相關，說明它們之間可能存在功能冗余。

3.3 GjPOD4可能具有不同的功能

植物中存在不同的POD亞型，定位在細胞質(zhì)、過氧化物酶體、線粒體和葉綠體等不同的細胞器中，亞細胞定位不同可能與其功能有關。本研究亞細胞定位預測結果顯示GjPOD4主要定位于葉綠體和胞外區(qū)，暗示其可能為胞外分泌/細胞壁類型的PRX家族成員，參與細胞壁的新陳代謝，如木質(zhì)素的聚合反應[30]。GjPOD4基因的表達趨勢除在隱地疫霉處理下與GjPOD7和GjPOD42相近外，在其他處理條件下與其他3個GjPOD差異極大。在SA處理早期的GjPOD4受誘導程度也顯著高于其他GjPOD，推測其可能參與植物系統(tǒng)獲得性抗性[17]。以上結果表明GjPOD4的功能可能與其他GjPOD有所差異。