張騰國，李 瑤，刁志宏，史中飛，王 娟，鄭 晟

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

在自然環(huán)境中，植物的生長會受到各種非生物脅迫的影響，例如干旱、高鹽和極端溫度，是世界許多地區(qū)植物生長和生產(chǎn)力最重要的制約因素之一，植物對逆境的反應(yīng)很復(fù)雜，涉及細(xì)胞、生理生化和分子機(jī)制。最近的研究表明，在脅迫條件下，植物細(xì)胞能夠感知并通過活性氧(reactive oxygen species，ROS)信號誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)，作為其脅迫耐受機(jī)制的一部分，而NADPH氧化酶是產(chǎn)生ROS的關(guān)鍵酶，能通過調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生來響應(yīng)不同的非生物脅迫和生物脅迫[1]，因此NADPH氧化酶在生物生長、發(fā)育過程中起重要作用[2-3]。在植物中，NADPH氧化酶也被稱為呼吸爆發(fā)氧化酶同系物(respiratory burst oxidase homolog，Rboh)，主要結(jié)構(gòu)包含6個保守的跨膜結(jié)構(gòu)域，其具有C-末端FAD和NADPH親水結(jié)構(gòu)域、2個血紅素基團(tuán)和2個N-末端Ca2+結(jié)合EF-手性基序。目前已經(jīng)在多種植物中鑒定和克隆得到Rbohs基因。擬南芥基因組含有10個NADPH氧化酶編碼基因，命名為AtRbohA-J，在整個植物發(fā)育過程和響應(yīng)環(huán)境因素時表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式[1,4]，AtRbohA，AtRbohB和AtRbohC只在根中表達(dá)，特別是在伸長區(qū)，且AtRbohC在根毛發(fā)育中起作用[5]，AtRbohH和AtRbohJ在花粉中表達(dá)，而AtRbohD和AtRbohF在所有植物器官中均表達(dá)[6]。同時，AtRbohD已被證明參與由多種非生物脅迫誘導(dǎo)的快速系統(tǒng)信號傳導(dǎo)[7]，能夠影響H2O2的積累，并參與乙烯信號傳導(dǎo)抑制根系伸長的釋放[8]，并且是擬南芥中血紅素加氧酶介導(dǎo)的鹽適應(yīng)信號傳導(dǎo)所必需的[9]。有研究表明，鹽脅迫能誘導(dǎo)AtrbohF基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)擬南芥根脈管系統(tǒng)的ROS水平，進(jìn)而響應(yīng)鹽脅迫[10]，番茄中大量的ROS積累能夠誘導(dǎo)SlRboh1基因(與AtRbohF同源)的表達(dá)水平上調(diào)[11]。也有研究表明，在大多數(shù)情況下，抑制NADPH氧化酶使得ROS積累減少，從而導(dǎo)致對細(xì)胞死亡和抗逆性的反應(yīng)的變化，如用DPI(二苯基碘)抑制NADPH氧化酶活性，減少了H2O2的產(chǎn)生，從而降低了水稻中乙烯誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率[12]，并導(dǎo)致番茄中幾種非生物脅迫相關(guān)的防御相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)[13]。

油菜屬于十字花科、蕓薹屬植物，是世界重要的油料作物之一，也是主要經(jīng)濟(jì)作物[14]，其中油菜作為中國第一大油料作物，其生產(chǎn)以冬油菜為主，占全國油菜種植面積的90%左右，而甘肅天水以西以北的廣大北方旱寒區(qū)氣候嚴(yán)寒，低溫、干旱少雨，地表水缺乏，土地沙漠化程度大，自然生態(tài)條件十分嚴(yán)酷，冬茬農(nóng)作物很難與嚴(yán)酷的冬季低溫、干旱抗?fàn)?，越冬十分困難，冬油菜尤其如此[15]。甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的‘隴油6號’強(qiáng)抗寒冬油菜品種，可在北方-32 ℃極端低溫條件下越冬，解決了北方冬油菜種植的越冬問題，為北方冬油菜種植提供了保障。而推廣冬油菜種植不但可以增產(chǎn)油料，在增加北方冬季土地覆蓋率、提高土壤有機(jī)質(zhì)、改善生態(tài)環(huán)境、減少沙塵暴等方面也有重要意義。

近年來研究表明，在植物應(yīng)答生物脅迫和干旱、冷、鹽、ABA以及重金屬等非生物脅迫時，可通過Rboh基因的表達(dá)變化而起作用。在鹽脅迫環(huán)境中AtRbohD和AtRbohF產(chǎn)生的ROS作為信號分子來調(diào)節(jié)體內(nèi)Na+/K+的平衡，從而提高了擬南芥的耐鹽性[16]；ABA 作為信號分子可以調(diào)節(jié)水分平衡和誘導(dǎo)脅迫耐受性，在擬南芥中通過ABA誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞使AtRbohD、AtRbohF基因表達(dá)[17]；玉米ZmRbohA/B/C/D基因表達(dá)受水分脅迫所誘導(dǎo)[18]，油菜RbohB基因表達(dá)受低溫、高鹽、H2O2誘導(dǎo)[19]。目前，以上關(guān)于其他植物中Rboh基因表達(dá)對非生物脅迫的響應(yīng)主要集中在RbohD基因方面，在油菜Rboh基因表達(dá)對非生物脅迫的響應(yīng)主要集中在RbohB基因方面，而RbohC和RbohF基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)還沒有相關(guān)報道。因此，本研究以抗寒性強(qiáng)的白菜型品種‘隴油6號’和抗寒性弱的‘天油2號’為研究材料，克隆得到了‘隴油6號’油菜NADPH氧化酶基因RbohC和RbohF，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討了抗寒性不同的2種油菜在低溫、干旱、鹽、ABA、H2O2、H2O2清除劑DMTU、MAPKK抑制劑U0126、NADPH氧化酶抑制劑DPI和IMD處理下，對油菜RbohC、RbohF基因表達(dá)水平的影響，為深入研究油菜RbohC、RbohF基因的生物學(xué)功能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料培養(yǎng)及處理

白菜型油菜(B.rapa)種子(‘隴油6號’和‘天油2號’)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。將購自上海森科園林公司的進(jìn)口的丹麥品質(zhì)草炭土與蛭石按2∶1的比例混合均勻，裝入事先用84消毒液消毒并洗滌干凈的小花盆中，用含有0.05 g/L艾美樂殺蟲劑(拜耳作物科學(xué)有限公司)的Hoagland營養(yǎng)液完全浸透土壤，挑選顆粒飽滿，大小一致的2種油菜種子若干，經(jīng)1% NaClO消毒后播種到營養(yǎng)土中，每盆8～10粒，播種結(jié)束后標(biāo)記，置于14 h/10 h(光照/黑暗)、250 μmol·m-2·s-1的光照培養(yǎng)架上培養(yǎng)大約4周左右后，挑選長勢一致的幼苗進(jìn)行以下處理：1)低溫處理：將長勢相同的2種油菜幼苗置于4 ℃低溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行不同時間段(12、24、36、48 h)的脅迫處理；2)PEG-6000模擬干旱處理：將2種油菜幼苗緩苗后分別浸泡于含有4個濃度PEG-6000(5%、10%、15%、20%)的Hoagland營養(yǎng)液中處理6 h；3)NaCl脅迫處理：將緩苗后的2種油菜幼苗分別浸泡于含有0、50、100、150、200 mmol·L-1NaCl的Hoagland營養(yǎng)液中處理12 h；4)ABA處理：長勢相同的2種油菜分別用50、100、150、200 μmol·L-1的ABA噴灑葉片，直到葉片滴水為止，處理12 h；5)H2O2處理：分別用5、10、15、20 mmol·L-1的H2O2噴灑2種油菜葉片，直到葉片滴水為止，處理12 h；6)抑制劑處理(包括H2O2清除劑DMTU、NADPH氧化酶抑制劑DPI和IMD、MAPKK抑制劑U0126處理)：將長勢一致的2種油菜幼苗從營養(yǎng)土中刨出，緩苗4 h后分別浸泡于含有10 μmol·L-1U0126、40 mmol·L-1DMTU、10 μmol·L-1DPI和 150 mmol·L-1IMD的 Hoagland營養(yǎng)液中處理12 h，處理結(jié)束后分別剪取上述處理的2種油菜葉片，用于總RNA提取。

1.2 油菜RbohC、RbohF基因的克隆

使用總RNA提取試劑盒(Bioteke公司)提取油菜葉片中的總RNA，參照PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)合成cDNA的第一條鏈。

從GenBank查找并下載RbohC(GenBank 登錄號：XM_009134386)、RbohF(GenBank 登錄號：XM_009114548)基因的預(yù)測序列，并依照RbohC、RbohF基因的預(yù)測序列設(shè)計引物RBOHC-U、RBOHC-D、 RBOHF-U、RBOHF-D(表1)。以‘隴油6號’油菜反轉(zhuǎn)錄cDNA為模版，按照Premix Ex Taq DNA Polymerase 說明書(TakaRa公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：Premix Ex Taq DNA Polymerase 12.5 μL，上下游引物和模板各1 μL，加滅菌ddH2O至總體積25 μL。PCR擴(kuò)增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，46.5 ℃(克隆RbohF基因CDS區(qū)時52 ℃)退火15 s，72 ℃延伸3 min，循環(huán)30次后72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1%的瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測，按照EasyPure Quick Gel Extraction Kit(離心柱型)回收試劑盒(全式金公司)進(jìn)行目的片段的回收，回收產(chǎn)物與pTG19-T vector載體連接，反應(yīng)體系與條件為：T4DNA Ligase Buffer 0.5 μL、膠回收產(chǎn)物3.5 μL、pTG19-T vector載體0.5 μL、T4DNA Ligase 0.5 μL，置于4 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)化Trans5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，送華大基因公司測序。

表1 PCR引物序列

1.3 目的基因序列及其蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

利用在線工具ExPASy ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)分析2種蛋白質(zhì)的分子量、理論等電點、不穩(wěn)定性和平均疏水性，SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和ProtCompv.9.0(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompp)工具在線預(yù)測該蛋白的信號肽和亞細(xì)胞定位；利用SMART程序(http://smart.embl-heidelb-erg.de)NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/ cdd/ cdd.shtml)、TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和TMpred(http:// www.ch.embnet. org/softwa-re/TMPRED_form.html)預(yù)測EF手性模體結(jié)構(gòu)(EF-hand)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)、黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(FAD)、NAD焦磷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和NADP核糖保守結(jié)合位點，并使用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對，Mega 5.0軟件對油菜的Rbohs蛋白進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 油菜RbohC、RbohF基因在不同組織及非生物脅迫下的表達(dá)

剪取長勢相同的2種油菜不同組織(根、莖、葉)，通過實時熒光定量PCR檢測油菜RbohC、RbohF基因在不同組織中的表達(dá)模式。提取低溫、PEG-6000模擬干旱、ABA、H2O2處理后的‘隴油6號’和‘天油2號’葉片總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以ActinF、ActinR為管家基因引物，RBOHC-U1、RBOHC-D1為RbohC引物，RBOHF-U1、RBOHF-D1為RbohF引物，依據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa公司)用25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行定量檢測，每個樣品做3個重復(fù)。定量反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，40次循環(huán)；55～95 ℃每30 s升高0.5 ℃，81個循環(huán)。每個樣品均重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法[14]分析基因的相對表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用Excel 2013軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜RbohC、RbohF基因的克隆

從GenBank中查找RbohC(GenBank登錄號：XM_009134386)、RbohF(GenBank 登錄號：XM_009114548)基因的預(yù)測序列，根據(jù)預(yù)測序列設(shè)計引物以抗寒性強(qiáng)的‘隴油6號’油菜總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模版，擴(kuò)增得到2條3 000 bp左右的單一條帶(圖1，A和圖1，B)，測序得到全長3 050 bp的油菜RbohC基因序列和2 995 bp的RbohF基因序列；與NCBI中公布的RbohC(XM_009134386)進(jìn)行blast比對，克隆得到的的油菜RbohC基因序列與其完全一致，其包含2 733 bp的開放閱讀框，起始密碼子ATG之前有72 bp的5′非翻譯區(qū)，終止密碼TAA之后有245 bp的3′非翻譯區(qū)，其編碼910個氨基酸(圖1，A)；克隆得到的油菜RbohF基因序列包含2 847 bp的開放閱讀框，起始密碼子ATG之前有56 bp的5′非翻譯區(qū)，終止密碼TAA之后有92 bp的3′非翻譯區(qū)，其編碼948個氨基酸(圖1，B)，與NCBI中公布的RbohF氨基酸序列比對，有3處突變，分別是84位的異亮氨酸(Ile)→甲硫氨酸(Met)，458位的苯丙氨酸(Phe)→纈氨酸(Val)，495位的纈氨酸(Val)→異亮氨酸(Ile)，進(jìn)行多次獨(dú)立重復(fù)實驗，突變位點是一致的，可能是由于不同物種特異性所致。

2.2 油菜RbohC、RbohF基因編碼蛋白同源性比較與結(jié)構(gòu)分析

利用DNAMAN軟件，將克隆的油菜RbohC、RbohF基因編碼的氨基酸與NCBI中登錄的擬南芥AtRbohC (AAS15724.1)、蘿卜RsRbohC (XP_018476885.1)、鹽芥EsRbohC (XP_006402027.1)、草莓FvRbohC (XP_004309557.1)、擬南芥AtRbohF (NP_564821.1)、蘿卜RsRbohF (XP_018457117.1)、薺菜CrRbohF (XP_006301285.1)、鹽芥EsRbohF (XP_006391675.1)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析和多重序列比對，結(jié)果表明(圖2)，油菜RbohC、RbohF編碼蛋白與多種植物相應(yīng)蛋白氨基酸序列具有較高的同源性，且兩者都與蘿卜RsRbohC同源性最高，分別為95%和96%，這些序列高度保守并且含有NADPH氧化酶的典型保守結(jié)構(gòu)域，包括2個可以與Ca2+結(jié)合的EF手性模體結(jié)構(gòu)(EF-hand)、6個跨膜結(jié)構(gòu)域(TM I-TM VI)、黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(FAD)、NAD焦磷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C末端區(qū)域中的NADP核糖保守結(jié)合位點。

M.DL4500圖1 油菜RbohC、RbohF基因片段電泳圖Fig.1 RbohC and RbohF gene fragments electrophoresis in rapeseed

2.3 油菜RbohC和RbohF基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了探究油菜中RbohC和RbohF基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，從GenBank中檢索到擬南芥、蘿卜、鹽芥、草莓和薺菜的RbohC和RbohF編碼蛋白序列，用Mega 5.0軟件對油菜的RbohC和RbohF編碼蛋白進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果表明，油菜BrRbohC與蘿卜RsRbohC聚集在一個分支上，而油菜BrRbohF與薺菜CrRbohF進(jìn)化關(guān)系較密切。

2.4 油菜RbohC和RbohF基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

對油菜RbohC和RbohF基因編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)在線分析可知，油菜RbohC和RbohF蛋白的開放閱讀框長度分別為2 733 bp和2 847 bp，分子量分別為103 kDa和108k Da，理論等電點為9.47和9.21，不穩(wěn)定系數(shù)分別為42.96和47.18，為不穩(wěn)定蛋白；平均疏水性為-0.245和-0.269，為親水性蛋白，該家族蛋白均不存在信號肽序列，為非分泌蛋白，但油菜RbohC含有4個跨膜螺旋(TMHs)，其RbohF蛋白含有6個跨膜螺旋，亞細(xì)胞定位都為質(zhì)膜。

2.5 油菜RbohC、RbohF基因在不同組織中的特異性表達(dá)分析

植物NADPH氧化酶基因是個多基因家族，不同的Rbohs基因的組織分布、基因表達(dá)情況都不相同，本研究剪取長勢相同且在正常培養(yǎng)條件下生長的‘天油2號’和‘隴油6號’植株，提取其根、莖、葉和下胚軸中的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板實時熒光定量PCR檢測RbohC、RbohF基因在不同組織中的表達(dá)，實驗結(jié)果表明：RbohC、RbohF基因在2種油菜的根、莖、葉和下胚軸中均表達(dá)，且RbohC基因在2種油菜的根中表達(dá)量最高，葉中最低(圖4)，而RbohF基因在2種油菜的下胚軸中表達(dá)量最高，莖中最低(圖4)。

圖2 油菜RbohC和RbohF的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of RbohC and RbohF in rapeseed

AtRbohC、AtRbohF.擬南芥；RsRbohC、RsRbohF.蘿卜；EsRbohC、EsRbohF.鹽芥；FvRbohC.草莓；CrRbohF.薺菜; RbohC、RbohF.油菜；下同；EF-handⅠ、Ⅱ. 2個與Ca2+結(jié)合的EF手性模體結(jié)構(gòu)；TMⅠ～Ⅵ. 6個跨膜結(jié)構(gòu)域；FAD.黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域; NAD.焦磷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域；NADP. C末端區(qū)域中的NADP核糖保守結(jié)合位點圖3 油菜與其他植物RbohC、RbohF氨基酸序列比對AtRbohC and AtRbohF. Arabidopsis thaliana; RsRbohC and RsRbohF. Raphanus sativus; EsRbohC and EsRbohF. Eutrema salsugineum; FvRbohC. Fragaria vesca subsp. vesca; CrRbohF. Capsella rubella; RbohC and RbohF. Brassica rapa; EF-hand Ⅰ-Ⅱ. Two EF chiral phantom structures combined with Ca2+; TM Ⅰ-Ⅵ. 6 transmembrane domains; FAD. Flavin adenine dinucleotide binding domain; NAD. Pyrophosphate binding domain; NADP. NADP ribose conserved binding site in the C-terminal region; The same as belowFig.3 Alignment of the forecast amino acid sequence of RbohC and RbohF between rapeseed and other plant species

2.6 油菜RbohC、RbohF基因在不同脅迫下的表達(dá)分析

2.6.1低溫脅迫圖5，A表明，低溫脅迫處理不同時間(0、12、24、36、48 h)后，兩品種油菜的RbohC和RbohF基因的表達(dá)量都呈先上升后下降的趨勢，且RbohC、RbohF基因的表達(dá)量在‘隴油6號’中始終高于‘天油2號’；它們的RbohC基因的相對表達(dá)量均在36 h達(dá)到最大值，分別為對照的33.1和18.2倍，RbohF基因的相對表達(dá)量在12 h時達(dá)到最大值，分別為對照的4.9和3.1倍?？梢?，低溫誘導(dǎo)兩品種油菜RbohC和RbohF基因表達(dá)量的變化趨勢一致，但抗寒性強(qiáng)品種表達(dá)量及其變化幅度均明顯大于抗寒性弱品種，同時RbohF基因表達(dá)量達(dá)到峰值時間明顯早于RbohC基因，說明不同品種和基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)過程存在差異。

LYC、TYC分別代表‘隴油6號’和‘天油2號’品種的RbohC基因，而LYF、TYF分別代表‘隴油6號’和‘天油2號’品種的RbohF基因；相同品種同一基因內(nèi)不同字母表示基因表達(dá)量于組織間(處理間)在0.05水平存在顯著差異(P<0.05)；下同圖4 不同品種油菜RbohC、RbohF基因組織特異性表達(dá)LYC and TYC stand for RbohC gene in cultivar ‘Longyou 6’ and ‘Tianyou 2’, while LYF and TYF stand for RbohF gene in cultivar ‘Longyou 6’ and ‘Tianyou 2’, respectively; The different letters within the same gene and cultivar indicate significantly different expression among tissue (treatment) at 0.05 level (P<0.05); The same as belowFig.4 The expression of RbohC and RbohF in different tissues of different rapeseed cultivars

2.6.2干旱脅迫由圖5，B可知，PEG-6000模擬干旱脅迫處理(5%、10%、15%和20%)2種油菜6 h后，它們的RbohC和RbohF基因表達(dá)量都隨濃度增加而呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，且均比對照顯著升高，均在20% PEG-6000處理時表達(dá)量達(dá)到最大值；同時，在相同PEG-6000脅迫濃度下，‘隴油6號’兩基因表達(dá)量始終明顯高于‘天油2號’，RbohC基因表達(dá)量始終明顯高于RbohF基因表達(dá)量。研究結(jié)果表明，2種油菜中RbohC和RbohF基因表達(dá)隨干旱脅迫程度表現(xiàn)出相同的變化趨勢，但升高的幅度在品種間和基因間存在差異，并以抗寒性強(qiáng)品種和RbohC基因升高幅度較大，即不同品種和基因?qū)Ω珊得{迫的響應(yīng)也存在差異。

2.6.3鹽脅迫圖5，C顯示，用不同濃度的NaCl(0、50、100、150、200 mmol·L-1)處理2種油菜，RbohC和RbohF基因的表達(dá)量均呈先上升后下降的趨勢。其中，RbohC基因的表達(dá)量在‘隴油6號’和‘天油2號’中分別比對照提高1.3～4.7倍和0.85～3.8倍，并均在150 mmol·L-1NaCl處理下達(dá)到最大值；RbohF基因的表達(dá)量在‘隴油6號’和‘天油2號’中分別比對照提高1.3～3.7倍和1.1～1.9倍，且均在100 mmol·L-1NaCl處理下達(dá)到最大值?？梢?，油菜RbohC和RbohF基因的表達(dá)隨鹽脅迫濃度的整體變化趨勢一致，但表達(dá)量因品種和基因而異，其中抗寒性強(qiáng)的品種明顯高于抗寒性弱品種，RbohC基因在低濃度(50～100 mmol·L-1)時低于RbohF基因，在高濃度(150～200 mmol·L-1)時則高于RbohF基因。

2.6.4ABA處理從圖5，D來看，2種油菜經(jīng)不同濃度的外源ABA(50、100、150、200 μmol·L-1)處理12 h后，RbohC和RbohF基因的表達(dá)在2種油菜中表現(xiàn)出不同的變化趨勢。其中，RbohC基因表達(dá)量在‘隴油6號’隨ABA濃度增加而逐漸升高，比對照組提高3.4～61倍，而在‘天油2號’中呈先升高后下降的趨勢，并在100 μmol·L-1時達(dá)到最大值，比對照提高6.8倍；RbohF基因表達(dá)量在‘隴油6號’中隨外源ABA 濃度的升高呈先升后降的趨勢，比對照提高1.9倍～4.5倍，并在150 μmol·L-1時達(dá)到最大值，而在‘天油2號’中與外源ABA 濃度呈正向相關(guān)，比對照提高1.8～3.3倍。這表明油菜RbohC和RbohF基因的表達(dá)均受到ABA的誘導(dǎo)，但在2種油菜品種中整體變化趨勢和幅度均不同，其在抗寒性強(qiáng)品種中表達(dá)量明顯高于抗寒性弱品種，而RbohC表達(dá)量又高于RbohF，尤其以抗寒性強(qiáng)品種RbohC表達(dá)量變化最為突出。

2.6.5H2O2處理用不同濃度的H2O2(5、10、15、20 mmol·L-1)處理2種油菜12 h后，RbohC和RbohF基因的表達(dá)量均呈先升高后下降的變化趨勢(圖5，E)。其中，‘隴油6號’和‘天油2號’RbohC基因的表達(dá)量均在15 mmol·L-1時達(dá)到最大，分別比對照顯著增加了6.4和5.5倍；RbohF基因的表達(dá)量在‘隴油6號’中于10 mmol·L-1時達(dá)到最大，比對照組顯著提高5.9倍，而在‘天油2號’中于15 mmol·L-1時達(dá)到最大，為對照的3.1倍。以上結(jié)果表明，油菜RbohC和RbohF基因的表達(dá)均受到H2O2的誘導(dǎo)，且表達(dá)量隨脅迫濃度的整體變化趨勢在2種油菜中一致，但表達(dá)量因品種和基因而異，具體表現(xiàn)為抗寒性強(qiáng)品種明顯高于抗寒性弱品種，RbohC基因高于RbohF基因。

2.6.6抑制劑處理‘隴油6號’和‘天油2號’經(jīng)DPI、IMD、DMTU和U0126處理12 h后，其RbohC、RbohF基因的表達(dá)量均比對照大幅顯著下降(圖5，F(xiàn))，但兩品種和基因其受 DPI、IMD、DMTU和U0126的抑制強(qiáng)度存在差異；RbohC基因表達(dá)量受到DMTU和U0126的抑制程度明顯較大，而RbohF基因均受各抑制劑的嚴(yán)重影響，同時‘隴油6號’表達(dá)量受各抑制劑的影響始終比‘天油2號’輕。表明DPI、IMD、DMTU和U0126均能顯著抑制兩品種油菜RbohC、RbohF基因的表達(dá)，但抑制程度因品種和基因而異，抗寒性弱品種和RbohF基因更易受到影響。

圖5 不同逆境脅迫和抑制劑處理下油菜RbohC和RbohF基因表達(dá)分析Fig.5 Analysis of RbohC and RbohF gene expression in rapeseed under different stresses and inhibitors

3 討 論

NADPH氧化酶最早發(fā)現(xiàn)于人免疫系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞，是一個異源多聚體蛋白。在植物應(yīng)答生物脅迫和干旱、冷、鹽、ABA、H2O2等非生物脅迫反應(yīng)時，質(zhì)膜NADPH氧化酶通過短時間內(nèi)大量產(chǎn)生信號分子活性氧(ROS)調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞的新陳代謝，是誘導(dǎo)產(chǎn)生超氧化物生成所必需的，使植物及時應(yīng)對逆境脅迫作出反應(yīng)，以適應(yīng)環(huán)境的變化[19-20]。本研究從‘隴油6號’油菜中克隆得到了含完整編碼序列的NADPH氧化酶RbohC和RbohF基因，序列分析表明油菜RbohC和RbohF基因與其他植物中已克隆得到的RbohC和RbohF基因同源性很高。不同逆境脅迫均可以誘導(dǎo)Rbohs基因的表達(dá)變化，但不同的Rbohs基因的組織分布、基因表達(dá)情況都不相同。有研究表明機(jī)械損傷能夠誘導(dǎo)番茄Rbohs基因的表達(dá)[21]和馬鈴薯塊莖中St-rbohA基因表達(dá)上調(diào)[22]。輕度鹽脅迫會誘導(dǎo)ROS積累和AtRbohD表達(dá)呈雙峰變化[23]。干旱、高溫、鹽和外源Ca2+可以誘導(dǎo)水稻中9個rboh基因的特異性表達(dá)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低溫、PEG-6000模擬干旱、鹽處理后，‘隴油6號’和‘天油2號’油菜RbohC、RbohF基因的表達(dá)與對照相比均明顯增加，但‘隴油6號’中RbohC和RbohF基因受誘導(dǎo)程度均高于‘天油2號’，表明油菜RbohC、RbohF基因的表達(dá)受到低溫、干旱、鹽脅迫的誘導(dǎo)，該基因在響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮作用，而抗寒性強(qiáng)品種RbohC和RbohF基因?qū)γ{迫的響應(yīng)更敏感。同時，低溫脅迫和PEG-6000模擬干旱脅迫下油菜RbohC基因的表達(dá)量均高于RbohF基因，可能在低溫脅迫和干旱脅迫下油菜RbohC的作用更明顯。另外，隨著鹽脅迫濃度的升高，油菜RbohC基因的表達(dá)量高于RbohF基因，表明油菜RbohC基因響應(yīng)鹽脅迫誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)更敏感。

脫落酸(ABA)在植物的整個生長發(fā)育過程中和植物應(yīng)對各種生物和非生物脅迫的反應(yīng)中起重要作用[25]，NADPH氧化酶已被證實是ABA誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的主要來源，ROS的大量產(chǎn)生會引起植物體ABA含量的升高，從而介導(dǎo)ABA信號通路。擬南芥的保衛(wèi)細(xì)胞中ABA能夠誘導(dǎo)AtRbohD和AtRbohF表達(dá)[26-27]。玉米中的研究發(fā)現(xiàn)，水分脅迫能引起的內(nèi)源ABA含量升高，外源ABA能夠誘導(dǎo)NADPH氧化酶活性的顯著提高，且伴隨有大量的活性氧的產(chǎn)生[28]。在玉米葉片中，ABA能夠誘導(dǎo)4個編碼NADPH氧化酶基因(ZmrbohA-D)表達(dá)，且這些基因的表達(dá)具有雙峰特征[29]。本研究中，外源ABA能誘導(dǎo)2種油菜RbohC、RbohF基因的表達(dá)上調(diào)，且‘隴油6號’中RbohC和RbohF基因受誘導(dǎo)程度均高于‘天油2號’，表明油菜RbohC、RbohF基因可能與ABA信號途徑有關(guān)，參與植物對非生物脅迫的響應(yīng)，其中抗寒性強(qiáng)的油菜RbohC和RbohCF基因?qū)BA的響應(yīng)更敏感。

MAPK激酶級聯(lián)途徑是調(diào)節(jié)植物多種非生物脅迫的重要途徑之一，且MAPK參與NADPH氧化酶活性的調(diào)節(jié)，番茄中NO和NADPH氧化酶依賴性氧化爆發(fā)也受MAPK信號調(diào)節(jié)[30]，玉米中ZmMPK5可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子而正反饋調(diào)節(jié)NADPH氧化酶的基因表達(dá)與酶活性，從而放大H2O2信號[31]；此外，H2O2能夠誘導(dǎo)NADPH氧化酶基因表達(dá)產(chǎn)生ROS，并放大ROS信號，調(diào)控下游信號通路中的基因表達(dá)，促進(jìn)各種抗氧化防護(hù)酶活[32-33]。擬南芥突變體中，AtrbohD已被證實對于ROS信號的放大是必需的[34]。細(xì)胞內(nèi)較少的ROS通過NADPH氧化酶將ROS信號放大，使信號迅速向下游傳遞是ROS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要機(jī)制。但目前對H2O2能否負(fù)反饋調(diào)節(jié)MAPK激酶級聯(lián)途徑，抑制RBOH的表達(dá)，降低ROS的積累方面的研究較少。本研究中用MAPKK抑制劑U0126處理油菜后，其RbohC、RbohF基因的表達(dá)均被抑制，表明油菜RbohC、RbohF基因的表達(dá)受到MAPK激酶信號途徑的調(diào)節(jié)，而用H2O2處理后RbohC、RbohF基因的表達(dá)上調(diào)，H2O2清除劑DMTU、NADPH氧化酶抑制劑DPI和IMD處理下油菜RbohC、RbohF基因的表達(dá)均被抑制，又表明油菜RbohC、RbohF基因的表達(dá)受到H2O2的反饋調(diào)節(jié)，但用H2O2、H2O2清除劑和NADPH氧化酶抑制劑處理油菜后‘隴油6號’中RbohC和RbohF基因受誘導(dǎo)程度均高于‘天油2號’，表明抗寒性強(qiáng)品種‘隴油6號’中RbohC和RbohCF基因?qū)2O2和MAPK激酶信號途徑的響應(yīng)更敏感，而MAPK激酶信號途徑、RbohC和RbohF以及H2O2之間是否存在著關(guān)聯(lián)調(diào)節(jié)機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。