李漢廣， 周秋香， 李志敏， 吳雅晴， 馬星星， 張慶華

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室/江西省菌物資源保護與利用重點實驗室，江西南昌 330045； 2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，江西南昌 330045)

在全球石油消耗量逐年增加和溫室效應(yīng)日趨嚴(yán)重的今天，當(dāng)務(wù)之急便是尋找一種清潔、可再生的新型能源。丁醇具有燃燒值高、腐蝕性小、疏水性強、揮發(fā)性低以及可與汽油以任意比例混合等優(yōu)點，因此頗受關(guān)注且被認(rèn)為是理想的第2代生物質(zhì)能源[1-2]。目前進(jìn)行丙醇(acetone)、丁醇(buatnol)、乙醇(ethanol)發(fā)酵(簡稱丙酮丁醇發(fā)酵或ABE發(fā)酵)所用的微生物主要有丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、糖乙酸多丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)和糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)等4種[3]，這4種生產(chǎn)菌均為桿狀、產(chǎn)芽孢、具有運動特性的典型厭氧菌。丙酮丁醇產(chǎn)生菌的代謝過程可分為產(chǎn)酸階段和產(chǎn)溶劑階段，在產(chǎn)酸階段，菌體迅速生長，產(chǎn)生大量的氣體(H2和CO2)，同時乙酸、丁酸等有機酸大量積累，因此此時發(fā)酵液的pH值急劇下降；當(dāng)發(fā)酵液的pH值下降到一定值時，丁醇及其他有機溶劑逐漸產(chǎn)生，ABE發(fā)酵過程進(jìn)入到產(chǎn)溶劑階段，乙酸和丁酸逐漸被消耗，發(fā)酵液pH值逐漸回升。有研究表明，當(dāng)發(fā)酵液中的丁酸濃度超過2.0 g/L時，將導(dǎo)致相轉(zhuǎn)型的發(fā)生，使丁酸重新被利用，發(fā)酵由此進(jìn)入產(chǎn)溶劑階段[4]。

傳統(tǒng)的ABE發(fā)酵主要以玉米粉等糧食作物為發(fā)酵原料，這不僅導(dǎo)致傳統(tǒng)的ABE發(fā)酵生產(chǎn)成本過高，還給原本早已匱乏的糧食資源造成沉重負(fù)擔(dān)。于是，利用廉價且來源廣泛的生物作物作為原料進(jìn)行丁醇等溶劑的生產(chǎn)成為各國科研工作者研究的熱點[5]。

葛根別稱葛條、甘葛，為豆科葛屬，有透疹、解肌退熱、生津止渴、升陽止瀉的功效。常用于表證發(fā)熱、脾虛泄瀉、項背強痛、熱病口渴、麻疹不透、陰虛消渴、熱瀉熱痢等癥狀。中國大部地區(qū)均有產(chǎn)，且主要分布在遼寧、江西、湖南、甘肅等地。

葛渣中含有豐富的纖維素、半纖維素等，是葛根提取葛根總黃酮、葛根精粉等有效成分后所產(chǎn)生的副產(chǎn)物[6]。但由于粗纖維含量高，因此大部分被棄置，造成了資源浪費。若以葛渣為原料進(jìn)行ABE發(fā)酵，不僅解決了制藥或食品企業(yè)廢物排放等問題，而且能變廢為寶生產(chǎn)生物燃料。

為此，本試驗以實驗室保存的丙酮丁醇梭菌ART18(C.acetobutylicumART18)為ABE發(fā)酵菌株，對葛渣水解液進(jìn)行ABE發(fā)酵的可行性進(jìn)行了初步的研究，同時通過研究溫度、pH調(diào)節(jié)劑的種類和含量及活性炭添加量等對丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量的影響，以期提高ABE(主要是丁醇)的生產(chǎn)強度，為以葛渣為原料進(jìn)行ABE發(fā)酵的工業(yè)化提供一些較為有益的初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和接種物的準(zhǔn)備 本試驗所用菌種為江西農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室所保存的丙酮丁醇梭菌ART18(C.acetobutylicumART18)。將保存在-80 ℃的甘油管中的菌種解凍后轉(zhuǎn)移到新鮮的種子培養(yǎng)基中(Tryptone-yeast-extrace-acetate，TYA培養(yǎng)基)，在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48～72 h，然后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行ABE發(fā)酵培養(yǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 TYA培養(yǎng)基 葡萄糖含量60.0 g/L，可溶性淀粉含量40.0 g/L，胰蛋白胨含量3.0 g/L，酵母提取物含量 2.0 g/L，KH2PO4含量0.75 g/L，K2HPO4含量0.75 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O含量0.01 g/L，MgSO4·7H2O含量0.2 g/L，瓊脂含量20 g/L，CH3COONH4含量3.0 g/L，pH值6.0，蒸餾定容至1 000 mL，121 ℃熱壓滅菌15 min。

1.1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖含量60.0 g/L，酵母粉含量 2 g/L，KH2PO4含量0.5 g/L，K2HPO4含量0.5 g/L，對氨基苯甲酸含量0.001 g/L，維生素B1含量0.001 g/L，生物素含量0.000 01 g/L，MnSO4·H2O含量0.01 g/L，MgSO4·7H2O含量0.2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O含量0.01 g/L，NaCl含量 0.01 g/L，CaCO3含量3.0 g/L，121 ℃條件下熱壓滅菌 15 min[7]。

1.1.3 主要試驗設(shè)備與試劑 本試驗所用主要儀器有氣相色譜儀、小型中藥粉碎機、高速離心機等，主要試劑有生物素、硫酸鎂、硫酸亞鐵、HCl、NaOH等，以上試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 原料的預(yù)處理 將葛渣(由江西橫峰觀山月葛業(yè)股份有限公司惠贈)用機械研磨機磨成細(xì)小微粒，然后過篩選取直徑為50～100 μm的粉末，將粉末以200 g ∶2 L的比例浸泡于1%稀硫酸中，浸泡2～3 h后，將其置于121 ℃條件下熱圧滅菌60 min。冷卻至室溫，經(jīng)DNS法測還原糖含量后進(jìn)行濃縮，直至還原糖濃度達(dá)60～70 g/L[8]。

1.2.2 ABE發(fā)酵 用5% NaOH或5% HCl將配制好的以葛渣水解液替代碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值調(diào)至6.0，分別裝入?yún)捬跗恐?，裝液量為100 mL，然后置于滅菌鍋中在121 ℃中條件下熱壓滅菌15 min。從TYA培養(yǎng)基中挑出單菌落，接種于上述無菌培養(yǎng)液中，利用輸液針管通入加有體積分?jǐn)?shù)為1%的84消毒液的水中，從而達(dá)到厭氧環(huán)境，在37 ℃條件下厭氧靜止培養(yǎng)88～96 h。收集發(fā)酵液測定乙醇、丙酮及丁醇等溶劑的濃度。

1.2.3 ABE擴大發(fā)酵 將ABE發(fā)酵放大到5 L發(fā)酵罐水平。發(fā)酵原料為酸水解后的葛渣水解液，裝液量為3 L，用5%NaOH或5%HCl將培養(yǎng)液的pH值調(diào)至6.0，37 ℃條件下厭氧發(fā)酵直到發(fā)酵結(jié)束。接種前后通入無菌高純氮氣，以除去培養(yǎng)基中殘存的氧氣，以保證整個發(fā)酵過程都在無氧條件下進(jìn)行。在發(fā)酵過程中，無須控制發(fā)酵液pH值，靜止培養(yǎng)。定期收集發(fā)酵液(10 mL)進(jìn)行丁醇、乙醇及丙酮等溶劑濃度的測定。

1.2.4 樣品的測定 取10 mL樣品經(jīng)5 000 r/min離心 5 min，然后取上清液與1.21 g/L異丁醇溶液以1 ∶4體積比混合，將所得混合液體采用氣相色譜儀(安捷倫)進(jìn)行定量檢測[9]。色譜柱為PEG-20M毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.4 μm)，檢測器溫度為240 ℃，進(jìn)樣溫度為240 ℃，柱溫為90 ℃。以異丁醇作內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量檢測，進(jìn)樣量為0.4 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解液殘渣對ABE發(fā)酵的影響

為探究水解液殘渣對ABE發(fā)酵的影響，本試驗以未去除水解液殘渣的水解液與去除水解液殘渣的水解液作為碳源，研究其對ABE發(fā)酵的影響，試驗結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，水解液殘渣的去除與否對ABE發(fā)酵具有較顯著的影響。去除水解液殘渣后，丁醇、總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為5.39、10.57 g/L，與未去除水解液殘渣的丁醇、總?cè)軇┊a(chǎn)量相比分別提高了131.3%、108.1%。未去除殘渣的發(fā)酵液處理，不僅菌體生長緩慢，而且最終丁醇等溶劑產(chǎn)量也較低。一方面可能是因為未去除水解液殘渣的發(fā)酵液黏度較大，從而影響了菌體的擴散，進(jìn)而使得營養(yǎng)物質(zhì)的利用率下降，使菌體生長緩慢，最終導(dǎo)致溶劑產(chǎn)量較低；另一方面可能是由于水解液殘渣中含有毒性物質(zhì)，從而影響了菌體的生長以及代謝產(chǎn)物的積累。

從本試驗研究結(jié)果可以得出，葛渣經(jīng)酸水解后，固體殘渣的除去對ABE發(fā)酵有著至關(guān)重要的影響，即不僅可以縮短菌體生長時間，而且可以有效提高溶劑的產(chǎn)量。因此，在本研究的以后試驗中均以除去殘渣的水解液為原料進(jìn)行ABE發(fā)酵。

2.2 溫度對ABE發(fā)酵的影響

溫度與微生物生長繁殖和產(chǎn)物的積累有著密切的聯(lián)系，合適的溫度不僅能夠使菌體迅速生長繁殖，同樣也能使發(fā)酵產(chǎn)物在最短的時間內(nèi)得到最大量的積累。為提高丁醇的產(chǎn)量，本試驗研究了不同溫度對ABE發(fā)酵的影響(以除去殘渣的葛渣水解液為發(fā)酵原料)，試驗結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，在發(fā)酵過程中，低溫(33 ℃)組的產(chǎn)氣速度明顯比其他組要慢(結(jié)果未列出)，溶劑的產(chǎn)量隨溫度的升高而逐漸升高，且在37 ℃時達(dá)到最大；當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時，溶劑的產(chǎn)量迅速降低。在低溫環(huán)境中，微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性相對較低，菌體生長緩慢，溶劑積累少；溫度過高，微生物生長迅速，溶劑迅速積累，對菌體自身產(chǎn)生抑制，甚至引起菌體提前衰亡，故而溶劑產(chǎn)量相對難以提高。在37 ℃時，丁醇、總?cè)軇┑漠a(chǎn)量都達(dá)到最大，具體分別為5.59、9.70 g/L。因此，接下來的發(fā)酵試驗均在37 ℃條件下進(jìn)行。

2.3 不同種類和含量的pH值調(diào)節(jié)劑對ABE發(fā)酵的影響

王風(fēng)芹等研究指出，恰當(dāng)?shù)木彌_介質(zhì)可明顯提高碳水化合物的利用率，從而提高丁醇產(chǎn)量[10]。本試驗將不同的pH值調(diào)節(jié)劑[CaCO3(2.0、4.0、8.0 g/L)、Na2CO3(2.0、4.0、8.0 g/L)、NaHCO3(2.0、4.0、8.0 g/L)、KH2PO4與K2HPO4(0.50、0.75、1.0 g/L，質(zhì)量比1 ∶1)]添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，以研究不同種類和含量的pH值調(diào)節(jié)劑對ABE的影響，各組中最適添加量條件下丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量結(jié)果如圖3所示。

試驗結(jié)果表明，當(dāng)碳酸鈣、碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀(1 ∶1)的添加量分別在4.0、2.0、4.0、0.75 g/L時，丁醇及總?cè)軇┑漠a(chǎn)量在各自組中較高。添加了pH調(diào)節(jié)劑的發(fā)酵液最終pH值均高于對照組(結(jié)果未列出)。從圖3的試驗結(jié)果可知，當(dāng)添加的碳酸鈣濃度為4.0 g/L時，丁醇、總?cè)軇┑漠a(chǎn)量在各自最優(yōu)條件下最高，具體分別為6.78、12.0 g/L，與對照組相比分別提高了15.5%、21.6%。

碳酸鈣的添加能明顯提高丁醇和丙酮的產(chǎn)量，且?guī)缀醪挥绊懸掖嫉漠a(chǎn)量(與對照相比僅提高7.4%)。此外有其他研究也表明，Ca2+可提高丁醇的產(chǎn)量，其主要原因可能是由于二價離子(Ca2+)的存在提高了細(xì)胞膜蛋白的穩(wěn)定性，從而提高丁醇產(chǎn)量[11]。

在ABE發(fā)酵過程中，當(dāng)發(fā)酵液中過量地積累有機酸(乙酸與丁醇)時，ABE的發(fā)酵將受到抑制；相反，如果有機酸積累得較少，ABE的生產(chǎn)強度將會提高。在本試驗中，當(dāng)添加了4.0 g/L碳酸鈣時，發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中殘存的總有機酸濃度最低，說明有較多的有機酸(特別是丁酸)重新轉(zhuǎn)化成丁醇，因此，在接下來的試驗中選用4.0 g/L碳酸鈣作為pH調(diào)節(jié)劑。

2.4 活性炭脫毒處理對ABE發(fā)酵的影響

分別使用1%、3%、5%活性炭對葛渣水解液進(jìn)行脫毒處理，比較各處理的還原糖含量以及ABE發(fā)酵的結(jié)果，試驗結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，葛渣酸水解液經(jīng)活性炭脫毒處理后進(jìn)行ABE發(fā)酵，3%活性炭的脫毒效果最好，此時丁醇、總?cè)軇┊a(chǎn)量為7.50、12.98 g/L，與對照組相比分別提高了 11.9%、14.9%。若活性炭濃度進(jìn)一步增加，溶劑濃度卻隨活性炭添加量的增加而減少。由此可推測，葛渣水解液中也存在較高濃度的發(fā)酵抑制物，而加入的活性炭可以吸附部分抑制物，從而提高ABE的發(fā)酵性能。然而，過高濃度的活性炭會造成還原糖的損失，因而降低溶劑的產(chǎn)量。接下來的試驗均采用3%活性炭進(jìn)行脫毒處理。

2.5 ABE擴大發(fā)酵

為在更大規(guī)模上驗證上述試驗結(jié)果，在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行擴大發(fā)酵。發(fā)酵起始條件：去除水解液殘渣的葛渣水解液為發(fā)酵原料，溫度37 ℃，用3%活性炭對水解液進(jìn)行脫毒處理，另外向發(fā)酵液中添加4.0 g/L碳酸鈣，厭氧靜止培養(yǎng) 88 h，發(fā)酵過程無須進(jìn)行pH值控制。

發(fā)酵結(jié)束時，總?cè)軇┑臐舛冗_(dá)到11.50 g/L，其中包括 2.50 g/L 乙醇、1.70 g/L丙酮和7.30 g/L丁醇。此時，總?cè)軇?、丁醇的生產(chǎn)強度分別為0.13、0.08 g/(L·h)。從上述試驗可知，在5 L發(fā)酵罐水平利用葛渣為主要發(fā)酵原料能順利地進(jìn)行ABE發(fā)酵，因此本試驗的研究結(jié)果可為以葛渣為原料工業(yè)化發(fā)酵產(chǎn)丁醇提供有益的初步探索。

3 討論與結(jié)論

葛渣作為葛等相關(guān)產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物，一般作為工業(yè)廢棄物進(jìn)行處理，由于其主要由纖維素、半纖維素及木質(zhì)素等成分組成，若通過一定的前處理使之成為ABE的發(fā)酵原料，必將對拓寬ABE發(fā)酵的原料譜系以及降低原料成本有著重要的意義。為此本試驗對以葛渣水解液為發(fā)酵原料進(jìn)行ABE發(fā)酵的可行性進(jìn)行了初步探究，在探索葛渣經(jīng)酸水解后的固體殘渣對ABE發(fā)酵的影響時發(fā)現(xiàn)，水解結(jié)束后去除未水解的固體殘渣能縮短菌體生長時間，同時還可以有效提高溶劑產(chǎn)量。當(dāng)研究發(fā)酵溫度對ABE的影響時發(fā)現(xiàn)，在低溫環(huán)境中，微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性相對較低，菌體生長緩慢，溶劑積累少；溫度過高，微生物生長迅速，溶劑迅速積累，因此對菌體自身產(chǎn)生抑制作用，容易引起菌體提前衰亡，故而溶劑產(chǎn)量相對難以提高。在37 ℃時，丁醇、總?cè)軇┑漠a(chǎn)量均達(dá)到最大，具體分別為5.59、9.70 g/L。

王風(fēng)芹等研究指出，恰當(dāng)?shù)木彌_介質(zhì)可明顯提高碳水化合物的利用率，從而提高丁醇產(chǎn)量[10]。在本試驗中，當(dāng)添加了4.0 g/L碳酸鈣時，發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中殘存的總有機酸濃度最低，說明有較多的有機酸(特別是丁酸)重新轉(zhuǎn)化成丁醇，而且在此條件下，丁醇、總?cè)軇┑漠a(chǎn)量最高，具體分別為6.78、12.0 g/L，與對照組相比分別提高了15.5%、21.6%，碳酸鈣中含有CO32-，當(dāng)將碳酸鈣加入到發(fā)酵液中CO32-可以起到pH值調(diào)節(jié)劑的作用，從而可有效防止發(fā)酵液pH值快速下降。同時，有研究表明Ca2+能夠提高細(xì)菌膜蛋白的穩(wěn)定性，從而能增強細(xì)胞的抗逆能力，在本試驗中加入碳酸鈣能提高ABE的發(fā)酵性能，這一結(jié)果與Han等的研究結(jié)果[12-13]一致。在對纖維素原料進(jìn)行水解時往往伴隨著劇烈的物理與化學(xué)反應(yīng)，在這一過程中會產(chǎn)生一定的對菌體生長有抑制作物的物質(zhì)，如糠醛、醛類、酚類化合物、乙酸等，因此在以纖維素為ABE發(fā)酵原料時，在水解完成后往往還須要一個有效的脫毒過程，以提高菌體的發(fā)酵性能[14]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，以3%活性炭的脫毒效果最好，此時丁醇、總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為7.50、12.98 g/L，與對照組相比分別提高了11.9%、14.9%。若活性炭濃度進(jìn)一步增加，溶劑濃度隨活性炭添加量的增加而減少。由此可推測，葛渣水解液中也存在較高濃度的發(fā)酵抑制物，而加入的活性炭可以吸附部分抑制物，從而提高ABE的發(fā)酵性能。然而，過高濃度的活性炭會造成還原糖的損失，因而降低溶劑的產(chǎn)量。為在更大規(guī)模上研究以葛渣為原料進(jìn)行ABE發(fā)酵的可行性，本研究在5 L發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行放大培養(yǎng)(最優(yōu)條件下)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)此時丁醇、總?cè)軇┑纳a(chǎn)強度分別達(dá)0.08、0.13 g/(L·h)。

生產(chǎn)成本過高一直是阻礙生物丁醇工業(yè)化的主要障礙之一，傳統(tǒng)的發(fā)酵原料如玉米、小麥及馬鈴薯等淀粉類糧食作物價格逐年攀升，若大規(guī)模應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，必將會給原本早已匱乏的糧食資源造成沉重負(fù)擔(dān)，我國已明令禁止利用玉米等糧食作物作為發(fā)酵原料進(jìn)行生物質(zhì)能源生產(chǎn)[15]。因此，選用廉價、易得的非糧作物或農(nóng)業(yè)種植廢棄物作為原料進(jìn)行生物煉制業(yè)已成為生物質(zhì)能源領(lǐng)域的研究熱點。通過本試驗的開展，證明了丁醇產(chǎn)生菌(丙酮丁醇梭菌ART18)可以利用葛渣水解液進(jìn)行ABE發(fā)酵，而且通過對水解產(chǎn)物進(jìn)行脫毒等處理以及對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化可提高丙酮丁醇梭菌ART18的ABE發(fā)酵性能，本研究結(jié)果可為工業(yè)化以葛渣為原料進(jìn)行ABE發(fā)酵提供一些有益的初步探索。