曾德永， 崔 杰， 張 萌， 關雙紅， 高 鑫， 山 珊， 劉夢瑤， 孫野青， 盧衛(wèi)紅

(1.哈爾濱工業(yè)大學化工與化學學院，黑龍江哈爾濱 150000； 2.大連海事大學環(huán)境科學與工程學院，遼寧大連 116026； 3.哈爾濱工業(yè)大學生命科學與技術學院，黑龍江哈爾濱 150000)

線粒體是真核細胞重要的細胞器，在細胞的能量代謝[1]、生物合成和細胞死亡[2](包括細胞凋亡和細胞程序性壞死)等過程中起關鍵的調(diào)控作用。此外，線粒體還參與三羧酸循環(huán)、交替氧化、脂肪酸和氨基酸氧化、鈣離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等重要的生理過程[3]。線粒體在維持生命穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，因而當機體受到生物脅迫和非生物脅迫時代謝調(diào)控網(wǎng)絡會發(fā)生改變，例如三羧酸循環(huán)、交替氧化、氧化磷酸化途徑等，并伴隨有活性氧(ROS)生成。本文主要討論當植物受到外界脅迫時，線粒體所表現(xiàn)出來的功能障礙和抗氧化應激的主要途徑。

1 線粒體

1.1 線粒體結構

線粒體為細胞提供了90%的能量，在植物細胞中，約有1%線粒體耗費的氧氣用于ROS的合成[4]。線粒體具有雙層膜結構，因此線粒體中有3個空間：線粒體膜外、膜間隙和膜內(nèi)。內(nèi)膜向內(nèi)突出形成嵴，在脂雙層膜上，大量呼吸作用相關的酶和蛋白分子都存在于內(nèi)膜和基質(zhì)中，而物質(zhì)轉運的蛋白質(zhì)載體和通道則在外膜上。線粒體主要進行能量合成、物質(zhì)代謝，是整個細胞乃至生命體進行生命活動的核心樞紐。此外，線粒體還參與細胞信號傳導[5]。線粒體的這些生理功能主要是通過調(diào)節(jié)能量代謝和ROS的生成來實現(xiàn)，線粒體通過操縱生物能學、氧化還原平衡、通透性轉換(MPT)等因素來調(diào)控細胞的生死[6]。

電子傳遞鏈是線粒體中不可缺少的組成部分，是一系列電子載體按對電子親和力逐漸升高的順序組成的電子傳遞系統(tǒng)。所有組成成分位于線粒體內(nèi)膜上，而且按順序分段組成分離的復合物，在復合物內(nèi)各載體成分的物理排列也符合電子流動的方向。其中線粒體中的電子傳遞鏈伴隨著營養(yǎng)物質(zhì)的氧化放能，又稱作呼吸鏈，主要由5個部分組成，分別為復合物Ⅰ泛醌氧化還原酶(NADH：ubiquinone oxidoreductase)、復合物Ⅱ稱琥珀酸泛醌氧化還原酶(SDH：ubiquinone oxidoreductase))、復合物Ⅲ細胞色素c氧化還原酶(Cyt：cytochrome C-oxidoreductas)、復合物Ⅳ細胞色素氧化酶(Cox：cytochrome oxidase)構成。這些大分子復合物中包含許多參與線粒體功能的小分子蛋白，當受到外界條件脅迫時，其功能很容易受到損傷。在動物中抑制NADH基因會使動物致死，但在植物中抑制NADH基因不會使植物致死，通過改變植物中線粒體編碼復合物Ⅰ亞基的基因表達，植物會表現(xiàn)出如發(fā)芽缺陷，生長遲緩，發(fā)育缺陷以及對激素或脅迫的反應改變[7-9]。植物復合物Ⅰ突變體已被廣泛用于研究復雜的Ⅰ結構、呼吸可塑性和代謝適應等[10-11]。復合Ⅱ耗竭增加植物中配子體致死率[12]，而復合物Ⅲ和Ⅳ的缺失則會使植物致死[13]。已有研究表明，線粒體復合物Ⅱ的功能紊亂與受輻射細胞的后代基因組不穩(wěn)定現(xiàn)象密切相關[14]。

植物線粒體內(nèi)除了細胞色素主路外還有抗氰交替途徑支路存在?？骨韬粑?交替途徑)指的是對氰化物不敏感的一條呼吸途徑。主要調(diào)節(jié)植物在逆環(huán)境中的生長發(fā)育，使植物適應環(huán)境脅迫[15]。

1.2 不同組織植物線粒體組成的變化

為了響應植物細胞代謝和能量需求的變化，線粒體通常通過改變呼吸鏈中關鍵蛋白質(zhì)的組成和豐度來改變其形態(tài)和呼吸能力。在這種方式下，線粒體被調(diào)整以滿足不同組織類型的能量需要或者響應于特定的環(huán)境。在植物突變體的研究中已經(jīng)觀察到線粒體在轉錄水平和穩(wěn)態(tài)方面的差異以及在不同組織中功能均有所不同。

在近期的一些逆向遺傳學研究中，編碼線粒體蛋白的核基因突變會使植物器官產(chǎn)生特異性表型，包括通過PPR蛋白質(zhì)缺失導致的植物延遲發(fā)育和開花[16-17]，通過沉默線粒體復合物Ⅰ、Ⅱ或線粒體蘋果酸脫氫酶改變?nèi)~形態(tài)和光合能力[18-19]。延胡索酸酶的抑制影響根系形態(tài)和呼吸速率并且其氣孔功能也會受到抑制[20]。目前已經(jīng)在轉錄水平上證明了一些核基因編碼的線粒體呼吸成分共同調(diào)節(jié)植物各種營養(yǎng)和生殖器官[21]。對這些共同調(diào)節(jié)的基因進行啟動子分析發(fā)現(xiàn)，這些基因中的啟動子近端存在常見位點Ⅱ，該位點可以引導器官特異性分化、代謝、對環(huán)境響應和發(fā)育等[22]。對基因功能類別分析發(fā)現(xiàn)，復合物Ⅰ和Ⅴ在組成型中表達，而編碼線粒體光呼吸機制和熱休克蛋白的基因在植物組織上進行選擇性表達[21]。雖然有很多試驗表明組織中轉錄本豐度和蛋白質(zhì)豐度/活性之間存在強相關性，但也存在許多特殊狀況，特別是NAD-蘋果酸酶(NAD-ME)、醛脫氫酶和硫氧還蛋白還原酶[23]。因此，基于單獨的轉錄本數(shù)據(jù)差異來解釋酶活性的組織特異性差異時，必須謹慎。

為了分析線粒體在植物發(fā)育過程中的特殊作用，對擬南芥中營養(yǎng)(細胞培養(yǎng)、根、芽)和繁殖(花粉、莖、花)發(fā)育階段的線粒體蛋白質(zhì)組進行了廣泛的比較[23]。通過雙向電泳，發(fā)現(xiàn)存在83個差異蛋白質(zhì)，包括TCA循環(huán)、呼吸鏈中的酶以及依賴于來自這些代謝途徑的中間體的關鍵酶。雖然電子傳遞鏈中單個亞單位的豐度通常在營養(yǎng)型組織中保持不變，然而呼吸能力則隨該特定組織、細胞類型對底物的選擇性和其對底物的可用性而改變[21]。測定蛋白質(zhì)豐度的差異可以預測不同器官/細胞類型之間代謝通量的變化程度[24]。通過在一個預先設計的線粒體圖上繪制這些代謝變化，可以精確定位這些由于組織特異化而變化的酶參與的步驟。營養(yǎng)器官/細胞的功能分析揭示了中樞碳代謝的特異性差異，芽線粒體在光呼吸時甘氨酸的分解中具有特殊的作用，細胞培養(yǎng)線粒體主要利用TCA循環(huán)中的檸檬酸和過氧化物酶體的β-氧化來驅動TCA循環(huán)和ATP形成的脫羧反應。而根線粒體具有較高的將2-氧戊二酸轉化為延胡索酸的能力，用于通過復合物Ⅱ產(chǎn)生能量。生殖期器官的線粒體往往在TCA循環(huán)以外的代謝中具有特殊的作用，如維持花粉中線粒體的氧化還原環(huán)境以及莖中的氮(谷氨酸)代謝。這些線粒體的特異性通常與相應組織類型的主要生理作用相符。例如，芽中蘋果酸脫氫酶的上調(diào)提供了其在調(diào)節(jié)氧化還原電位中作用的證據(jù)，這在光介導光合和呼吸作用中是至關重要的[18]。

大多數(shù)線粒體蛋白質(zhì)組學研究都通過比較特定蛋白質(zhì)的總豐度來關注特異性組織的基因轉錄調(diào)控和轉錄后對功能的影響。雖然蛋白質(zhì)的豐度有時與其最大催化活性相關，但是由于某些線粒體蛋白質(zhì)在不同組織中存在同種型豐度差異，因此這種關系不能應用于所有的酶[21，23]。例如，精氨酸酶的異構體1在營養(yǎng)器官中更高表達，而異構體2在生殖器官中表達更高[23]。當4種電壓依賴性陰離子通道(VDAC)同種型中的某一種被破壞時，也觀察到營養(yǎng)和生殖發(fā)育中同種型的特異性差異[25]?；虻谋磉_在調(diào)節(jié)酶活性以及蛋白質(zhì)修飾和酶復合物組裝的代謝途徑中也發(fā)揮關鍵作用。在雙向電泳中觀察到的一些被修飾的蛋白，特別是等電點發(fā)生位移的蛋白通常被認為是制備樣品時引入的雜質(zhì)。然而，在最近對來自不同器官、細胞類型的線粒體蛋白質(zhì)組的研究中，發(fā)現(xiàn)TCA循環(huán)、ETC中的許多蛋白質(zhì)，其組織特異性經(jīng)過翻譯修飾后，在不同的物種和組織中具有高度可重復性，表明這些變化不是隨機的。而蛋白質(zhì)翻譯修飾后的差異對不同組織中線粒體代謝功能的影響尚待探討。

1.3 線粒體活性氧

細胞中的ROS主要來源于線粒體，當ROS的清除機制失效時，線粒體的功能就會發(fā)生紊亂，當植物細胞暴露于高濃度的鈾環(huán)境下時，ROS誘導的氧化酶(如脂肪氧合酶)被激活，對應的基因表達水平也會增高，抗氧化物質(zhì)的調(diào)控和一些代謝活動也會發(fā)生改變[26]。線粒體電子傳遞鏈中發(fā)生電子泄漏是產(chǎn)生ROS的主要因素，在正常的呼吸過程中約有2%的電子發(fā)生泄漏[27]。長期以來，復合物Ⅰ和Ⅲ被認為是線粒體內(nèi)活性氧(ROS)產(chǎn)生的主要來源，但是近來在哺乳動物和植物中的研究表明，復合物Ⅱ也可能是ROS的重要來源[28-29]，復合物Ⅰ和Ⅲ中主要由O中心產(chǎn)生電子泄漏而產(chǎn)生ROS[30]。然而，復合物Ⅱ產(chǎn)生ROS的機理尚不清楚，并且在植物中線粒體復合物Ⅱ或其組裝因子的敲除會導致植物死亡，從而在很大程度上阻止通過基因敲除的手段進行直接研究[12，31]。但隨著研究的深入，該限制也發(fā)生了改變，當復合物Ⅱ中的SDH1-1(dsr1)發(fā)生突變時，復合物Ⅱ活性降低同時線粒體ROS含量增加[32]。復合物Ⅳ中不能直接產(chǎn)生ROS[30]，ROS的產(chǎn)生在植物細胞的信號傳導中發(fā)揮著重要作用[33]，但高含量的ROS將會損傷細胞DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，從而導致線粒功能紊亂[34]。很多研究表明，線粒中ROS會對植物細胞產(chǎn)生氧化損傷[35-36]。

1.4 氧化應激與線粒體功能

線粒體氧化應激能改變線粒體功能，如影響其參與的三羧酸循環(huán)，氨基酸代謝，氧化磷酸化過程[37-38]。三羧酸循環(huán)中的關鍵酶通常是辨別氧化應激是否發(fā)生的標志物[39]。氧化應激發(fā)生時，三羧酸關鍵酶[如丙酮酸脫氫酶(PDH)、檸檬酸合酶(CSY)、烏頭酸酶(Aco)、NAD+依賴性異檸檬酸脫氫酶(IDH)、延胡索酸酶(FUM)和蘋果酸脫氫酶(MDH)]的酶活性和酶基因的表達會發(fā)生不同程度的改變，但是改變方向卻不同，同時氨基酸的含量降低，不過其具體機制尚不清楚[40-41]。

氧化應激發(fā)生時，氧化磷酸化途徑中的復合物Ⅰ、復合物Ⅱ、復合物Ⅲ、復合物Ⅳ和ATP合成酶的基因表達量和活性會發(fā)生改變。同一復合物中不同亞基的基因在發(fā)生氧化應激時的表達量不同，并且在不同的植物組織中表達也不同[40]，復合物Ⅰ中nda1、ndb2在氧化應激發(fā)生時表達量會增加。而在復合物Ⅱ中sdh1通常表現(xiàn)出對氧化應激敏感[42]，同時發(fā)現(xiàn)SDH6和SDH7在氧化應激發(fā)生時對維持線粒體功能有重要作用[43]。COX是氧化磷酸化途徑的末端氧化酶，負責將電子傳遞給受體。在氧化應激發(fā)生時COX亞基cox1、cox2、cox17的表達量會發(fā)生改變，并且COX17的調(diào)節(jié)因子AtCOX17對調(diào)節(jié)植物的氧化應激反應有重要的作用[44-45]。ATP合酶由很多亞基組成，其中由線粒體基因編碼的亞基有ATP合酶F0亞基1、6、8，ATP合酶亞基β、γ、δ，ATP合酶亞基O等[46-47]。ATP合酶F0亞基通常會影響氧化應激反應[48]。

2 線粒體抗氧化應激的策略

植物抗氧化系統(tǒng)由許多酶和非酶抗氧化成分組成，與植物體內(nèi)ROS生成途徑一起維持ROS含量的動態(tài)平衡。很多研究已經(jīng)表明抗氧化系統(tǒng)在維持植物體內(nèi)ROS的穩(wěn)態(tài)中有重要的作用?？寡趸赶蛋ǔ趸锲缁?SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)等，主要作用是清除自由基。除此之外，植物體還可以通過其他途徑來達到抗氧化損傷的目的，比如通過控制抗氧化酶系基因表達，或者改變體內(nèi)其他抗氧化物，如改變抗壞血酸鹽、谷胱甘肽濃度。

植物體內(nèi)通常有3道防線用于其線粒體的抗氧化脅迫。第1道防線是防止ROS的產(chǎn)生，可采用維持可利用底物和ATP需求的平衡、AOX的活化、解偶聯(lián)蛋白的活化等方法。第2道防線則是通過抗氧化酶系、谷胱甘肽還原系統(tǒng)、硫蛋白還原系統(tǒng)清除機體內(nèi)多余的ROS。第3道防線則是通過切除修復DNA、二硫鍵的還原、修復蛋白等來修復ROS引起的損傷。

2.1 交替氧化途徑

植物線粒體中有2種催化氧還原成水的末端氧化酶(圖1)細胞色素(cyt)氧化酶(復合物Ⅳ)和交替氧化酶(AOX)[49]，交替氧化途徑可以起到電子分流的作用。有研究表明，丙酮酸可以刺激AOX與未飽和的細胞色素通路競爭電子，當主路中的復合物Ⅰ到復合物Ⅳ的活性受到抑制時，AOX的活性會升高數(shù)倍[50]。對AOX的電子流量進行生化控制，可以減少電子傳遞鏈產(chǎn)生ROS[51]。AOX分流電子的能力具有組織和發(fā)育的特異性[52]，機體代謝發(fā)生紊亂時AOX分流電子能力通常會增加[53]，在氧化應激發(fā)生時，aox1a基因的表達都會升高[54]。有研究表明，在AOX過量表達的細胞中ROS的量僅為對照細胞的一半，相反通過基因沉默技術減少AOX表達的細胞中的ROS的量是對照細胞的5倍，證明AOX可以降低氧化損傷的程度[55-56]。

2.2 解偶聯(lián)蛋白(UCP)

UCP是線粒體載體蛋白質(zhì)家族的成員，能使H+從線粒體內(nèi)膜滲透到線粒體內(nèi)，從而消除電子傳遞鏈中的電位差，導致氧化磷酸化途徑受損，因此將其作為非磷酸化/解偶聯(lián)呼吸途徑的重點研究。UCP可以被ROS激活，表明UCP與AOX一樣，可能會降低氧化損傷[57]，后來的研究也證明了AOX與UCP共同構成了抵御氧化損傷的防御體系[58]。UCP(AtUCP1)基因進行敲除后，導致局部氧化應激，但不會影響植物承受大部分非生物脅迫的能力。然而，UCP的缺失卻導致植物呼吸速率受阻，表明UCP1在葉中主要是維持線粒體電子傳遞鏈的氧化還原電位[59]。UCP能保護植物線粒體免受氧化損傷，維持植物細胞中的能量平衡。

2.3 植物中ROS清除劑

2.4 轉錄調(diào)節(jié)因子

轉錄因子(TF)是抗氧化應激反應的重要調(diào)控蛋白之一。它們在應激信號下游發(fā)揮著重要的作用，可以同時改變應激反應基因亞型的表達，增強植物對環(huán)境脅迫的適應性。AP2/ERF(APETALA2/乙烯應答因子)、鋅指結構域(zinc finger)、WRKY、bZIP(堿性-亮氨酸拉鏈)和NAC(NAM、ATAF、CUC)家族成員在植物受到外界脅迫條件誘導下的氧化應激中具有調(diào)節(jié)作用[75-76]。

含有鋅指結構域(zinc finger)的蛋白質(zhì)作為調(diào)控ROS相關防御基因的關鍵參與者在擬南芥中已經(jīng)被報道。在敲除AtAPX1基因的擬南芥中，鋅指基因ZAT7、ZAT10、ZAT12的表達加重了擬南芥的氧化損傷[77]，表明這些鋅指基因參與調(diào)控ROS。C2H2鋅指蛋白的ZFP36、ZFP1792種類型在調(diào)控水稻ROS平衡中發(fā)揮著重要作用。ZFP179基因過表達提高水稻中ROS清除能力和應激相關基因的表達水平，表現(xiàn)出顯著增強抗氧化應激的作用[78]。ZFP36增強了水稻在由脫落酸(ABA)誘導的氧化應激中的耐受性。此外，ZFP36在ABA信號的傳導中參與對NADPH氧化酶、H2O2和MAPK的調(diào)節(jié)[79]。OsTZF1是一種CCCH-串聯(lián)鋅指蛋白，是脅迫條件下水稻葉片衰老的負調(diào)控因子。同時，OsTZF1通過增強氧化還原穩(wěn)態(tài)基因和ROS清除酶基因的表達來提高水稻的氧化應激效應[79]。在擬南芥中CCCH-串聯(lián)型鋅指基因GhTZF1通過介導ROS穩(wěn)態(tài)參與調(diào)節(jié)由干旱脅迫誘導的氧化應激和葉片的衰老[80]。

WRKY家族蛋白具有1個或2個保守的WRKY結構域，其在N末端包含高度保守的WRKYGQK七肽，在C末端具有鋅指狀結構域。保守的WRKY結構域通過與目標基因的啟動子區(qū)域中的W-box元件結合而在各種生理過程中起重要作用。研究表明，在由干旱和鹽脅迫誘導的氧化應激中，WRKY基因GmWRKY27能顯著降低大豆根中的ROS水平，同時GmWRKY27與GmWRKY174相互作用，可以減少GmWRKY29的啟動子活性和基因表達[81]。后來的研究中表明，GmWRKY29是負調(diào)控因子，可以增加植物體內(nèi)ROS的含量，通過直接刺激編碼ROS產(chǎn)生酶系基因的表達。另有研究表明，WRKY基因GhWRKY17的過表達降低了煙草對干旱和鹽脅迫誘導的氧化應激的耐受性；后來的試驗表明，GhWRKY17通過調(diào)節(jié)ABA信號和ROS的水平參與氧化應激反應[82]。從短柄草中分離出的WRKY基因BdWRKY36，可以通過控制ROS穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)氧化應激相關基因的轉錄而對氧化應激反應進行調(diào)節(jié)[83]。

2.5 其他功能性蛋白質(zhì)

多胺(PA)是在所有活細胞中都存在的低分子量脂族胺。PA在生理pH下具有陽離子的性質(zhì)，因此對帶負電荷的分子(DNA、RNA和蛋白質(zhì))具有很強的結合能力，從而穩(wěn)定它們的結構。PA的生物合成途徑已經(jīng)在許多生物體中進行了深入的研究，而精氨酸脫羧酶(ADC)在PA的合成中起主要作用。在由干旱脅迫下，PtADC基因可以提高煙草和番茄內(nèi)源性PA水平，減少體內(nèi)ROS的積累，表現(xiàn)出對氧化應激的耐受性[84]。Jang等在水稻中的插入OsLDC-1序列后，發(fā)現(xiàn)該水稻具有高度抗氧化應激的特質(zhì)，與對照植物相比，該突變體的PA含量更高，表明PA可能通過減少ROS產(chǎn)生和增強ROS降解來介導植物對氧化應激的耐受性[85]。

解螺旋酶是細胞中普遍存在的酶，催化穩(wěn)定的雙鏈體DNA或RNA二級結構的展開，從而在DNA和RNA代謝過程中起重要作用。OsSUV3是水稻中NTP依賴的RNA和DNA解旋酶。在水稻中OsSUV3可以減少脂質(zhì)過氧化和H2O2產(chǎn)生，以及增加抗氧化酶的活性，從而表現(xiàn)出較強的抗氧化應激效應[86]。

鳥氨酸δ-氨基轉移酶(δ-OAT)是參與脯氨酸和精氨酸代謝的酶。在水稻中，OsOAT的過表達增加了δ-OAT活性和脯氨酸的含量，同時也增強了對干旱、鹽和氧化應激的耐受性[87]。

3 展望

線粒體作為真核細胞的一個古老而靈活的細胞器，通過能量代謝參與細胞生長和分裂。雖然現(xiàn)在對植物線粒體的研究正在快速增加，但是針對其功能的研究仍然是從酵母和哺乳動物系統(tǒng)中外推，而沒有對植物的直接研究。在以后的研究中，仍然需要對線粒體的組裝機制，線粒體氧化應激的信號傳導和呼吸頻率調(diào)節(jié)作更詳細的研究，以便在惡劣環(huán)境中最大限度地保護植物的呼吸作用，并盡量減少呼吸損失以提高植物產(chǎn)量。目前對植物線粒體氧化應激的研究大多是利用各種環(huán)境脅迫進行誘導，但對于空間輻射對線粒體影響的研究卻沒有被報道。隨著我國航天事業(yè)的蓬勃發(fā)展，今后應加大空間輻射對模式植物線粒影響方面的研究，為后續(xù)在空間站中對植物的研究奠定基礎。