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(1.湖北民族學(xué)院，林學(xué)園藝學(xué)院，種子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 恩施 445000；2.湖北省恩施土家族苗族自治州氣象局， 湖北 恩施 445000)

種子休眠是指在特定時(shí)期內(nèi)，不管各種有利于種子萌發(fā)的環(huán)境因子(如溫度和光照/黑暗等)以何種組合形式都不能使其萌發(fā)的現(xiàn)象[1]。它是植物在長期的自然進(jìn)化過程中形成的應(yīng)對(duì)自然環(huán)境和保存種族的一種適應(yīng)特性[2]，對(duì)于新物種的產(chǎn)生和現(xiàn)有物種的擴(kuò)散具有重要意義[3]。而在生產(chǎn)實(shí)踐中，種子休眠對(duì)于人類來說有利有弊，利在于休眠能使種子成功度過不適宜其萌發(fā)生長的特殊時(shí)期；弊在于播種時(shí)休眠會(huì)降低種子活力、影響出苗整齊度，并嚴(yán)重制約大規(guī)模常規(guī)育種和種苗生產(chǎn)[2]。

根據(jù)休眠原因，種子休眠可以分為生理休眠、形態(tài)休眠、形態(tài)生理休眠、物理休眠和復(fù)合休眠等五大類型，每一休眠類型又可進(jìn)一步分為若干休眠水平，且有些休眠水平還可進(jìn)一步分為若干休眠型[1-4]。其中，生理休眠是進(jìn)化上最高、系統(tǒng)發(fā)生樹上分布最廣的休眠類型[1-5]。通常，可通過溫度處理、機(jī)械處理、層積處理、光照處理、激素處理、化學(xué)藥劑處理及綜合處理等方法來解除種子休眠，使其萌發(fā)[6-8]，并可由此分析其休眠原因及確定其休眠的類型、水平和休眠型[1]。

薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)植物全世界約有750個(gè)種，分布遍及五大洲。中國約有194個(gè)種88個(gè)變種，分布遍及全國各地[9-10]。該屬很多植物均具有開發(fā)利用價(jià)值，有些種類的果實(shí)柔嫩多汁，營養(yǎng)豐富，可食用；有些種類的果實(shí)、種子、根及葉可入藥，具有活血化瘀、清熱解毒、止血止痛等功效[10]。光滑高粱泡(RubuslambertianusSer.var.glaberHemsl.)是懸鉤子屬高粱泡(R.lambertianusSer.)的一個(gè)變種，其果實(shí)可食，可加工成果汁、果酒或提取色素用作飲料添加劑[11]；其根和葉可入藥，有活血調(diào)經(jīng)、消腫解毒的作用[12]。高粱泡的生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，是23種優(yōu)良懸鉤子種質(zhì)資源之一[11-13]，極具開發(fā)潛力。

懸鉤子屬植物種子具有深度休眠特性，給選育種及物種保護(hù)等工作造成一定困難[14]，明確其休眠原因并找到高效的休眠解除方法具有重要意義。已有研究表明，懸鉤子屬植物種子休眠原因復(fù)雜多樣，包括硬質(zhì)種皮(實(shí)為內(nèi)果皮)妨礙透水透氣和胚生長[15-16]，種皮或胚乳內(nèi)含萌發(fā)抑制物質(zhì)[16-17]，胚發(fā)育不充分[14]等。用于解除懸鉤子屬植物種子休眠的方法主要有機(jī)械破皮處理、化學(xué)試劑處理、植物激素處理、低溫層積處理和變溫處理等[14]。目前有關(guān)高粱泡(R.lambertianus)種子休眠的研究鮮見報(bào)道，僅見張春紅等對(duì)高粱泡種子利用98% H2SO4和NaClO浸種后室溫沙藏(90 d)處理，但均未能有效解除休眠[18]，而對(duì)于變種光滑高粱泡種子休眠的研究尚未見報(bào)道。鑒于高粱泡的潛在利用價(jià)值，很有必要探明其種子休眠原因，并找到解除其休眠的最佳方法，為其規(guī)模繁殖和育種等工作的開展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試光滑高粱泡種子于2017年10月采自湖北省恩施鶴峰縣木林子國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)。去除果皮和雜質(zhì)后于室溫條件下陰干備用。

1.2 方 法

1.2.1 外源植物激素處理

選擇具有促進(jìn)種子休眠解除和萌發(fā)的外源植物激素GA3和6-BA對(duì)光滑高粱泡種子進(jìn)行處理。2種外源植物激素溶液均配制成0.000 1，0.001，0.01，0.1 mmol/L和1 mmol/L等5種濃度，以蒸餾水處理作為對(duì)照(ck)。

1.2.2 冷濕層積處理

將新鮮成熟種子與濕潤的珍珠巖(含水量60%，握之成團(tuán)，松手即散)按體積比1∶3充分混勻后裝于黑色聚乙烯袋中，隨后將其置于4 ℃黑暗條件下進(jìn)行冷濕層積處理。層積2，4，6，8周后取樣，并在指定溫度和光照條件下進(jìn)行萌發(fā)測(cè)試，以未經(jīng)層積處理的新鮮成熟種子為對(duì)照(ck)。

1.2.3 變溫處理

設(shè)置2種變溫：15 ℃/25 ℃和20 ℃/30 ℃，均為12 h光照/12 h黑暗交替光照條件(PPFD=121μmol/(mDK·s)，每天的光照時(shí)間與變溫的高溫階段相對(duì)應(yīng)。

1.2.4 萌發(fā)測(cè)試

所有萌發(fā)測(cè)試試驗(yàn)均設(shè)置4次重復(fù)，每重復(fù)50粒種子，將種子均勻播于墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿添加6 mL蒸餾水或不同濃度的外源植物激素溶液，為防止培養(yǎng)期間水分蒸發(fā)，每個(gè)培養(yǎng)皿在添加完蒸餾水或不同濃度的外源植物激素溶液后用封口膜進(jìn)行密封處理。然后置于指定溫度(恒溫或變溫)和光照[每天12 h光照/12 h黑暗交替光照，PPFD=121μmol/(m·s)]條件下進(jìn)行培養(yǎng)，定期記錄萌發(fā)數(shù)，萌發(fā)測(cè)試結(jié)束后統(tǒng)計(jì)并計(jì)算最終平均萌發(fā)率。以胚根突破內(nèi)果皮作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。

表1 冷濕層積對(duì)光滑高粱泡種子在各恒溫條件下休眠解除和萌發(fā)的影響

層積時(shí)間(周)萌發(fā)率10℃15℃20℃25℃30℃35℃01.5±0.5cB20.0±5.0aB27.0±4.6aA23.0±5.9aA10.0±1.6bA1.0±0.6cA20bB9.5±1.3aB16.5±3.4aA14.0±5.0aA6.0±2.2aA0bA41.5±1.5bB18.5±4.4aB15.5±6.0aA27.0±6.5aA4.0±0.8bA0bA635.5±13.0bA55.5±5.9aA11.0±2.4bA12.0±3.8bA8.0±2.2bA0cA842.5±9.2aA50.5±10.6aA27.0±2.5abA18.0±4.1bA6.0±1.2cA0dA

注：同列標(biāo)有相同大寫字母或同行標(biāo)有相同小寫字母的數(shù)據(jù)間無顯著性差異(p=0.05)。

初始萌發(fā)測(cè)試：培養(yǎng)溫度分別為5，10，15，20，25，30，35 ℃和40 ℃恒溫，培養(yǎng)期為30 d。

外源植物激素處理萌發(fā)測(cè)試：培養(yǎng)溫度為20 ℃，培養(yǎng)期為60 d。

冷濕層積處理后萌發(fā)測(cè)試：冷濕層積處理不同時(shí)間的種子分別被置于10，15，20，25，30 ℃和35 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)期為30 d。

變溫處理萌發(fā)測(cè)試：培養(yǎng)期為30 d。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0軟件對(duì)所有的萌發(fā)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有萌發(fā)數(shù)據(jù)均進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA，p=0.05)，其中初始萌發(fā)測(cè)試、外源植物激素處理和冷濕層積處理的萌發(fā)數(shù)據(jù)隨后還要進(jìn)行Student-Newman-Keuls驗(yàn)后多重比較(p=0.05)。為了保證方差齊性，所有萌發(fā)數(shù)據(jù)在進(jìn)行方差分析前都要先進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換。所有統(tǒng)計(jì)圖均通過GraphPad Prism 5.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 新鮮光滑高粱泡種子在恒溫條件下的初始萌發(fā)

恒溫對(duì)新鮮光滑高粱泡種子休眠解除和萌發(fā)具有顯著性影響(p<0.05,圖1)。15，20，25 ℃條件下的最終平均萌發(fā)率間無顯著性差異(p>0.05)，并顯著高于其他恒溫條件下的最終平均萌發(fā)率(p<0.05)，其中以20 ℃恒溫條件下的最終平均萌發(fā)率最高，為(27.0±4.6)%。30 ℃條件下的最終平均萌發(fā)率次之，為(10.0±1.6)%；10 ℃和35 ℃條件下的最終平均萌發(fā)率最低，不到5%，且兩者無顯著性差異(p>0.05)；5 ℃和40 ℃條件下則不萌發(fā)(圖1)。

2.2 變溫處理對(duì)新鮮光滑高粱泡種子休眠解除和萌發(fā)的影響

與20 ℃恒溫條件下的萌發(fā)進(jìn)程相比，2種變溫處理均能夠有效解除光滑高粱泡種子的休眠并促進(jìn)其萌發(fā)(圖2)。2種變溫處理的最終平均萌發(fā)率顯著高于20 ℃恒溫(最適恒溫，見圖1)條件下的最終平均萌發(fā)率(p<0.05)，且2種變溫處理的最終平均萌發(fā)率間無顯著性差異(p>0.05)，均達(dá)95%以上(圖2)。

注：每天12 h光照/12 h黑暗，PPFD=121 μmol/(m·s)。標(biāo)有相同小寫字母的數(shù)據(jù)間無顯著性差異(p=0.05)。下同。圖1 新鮮光滑高粱泡種子在各恒溫條件下的萌發(fā)

圖2 新鮮光滑高粱泡種子在2種變溫和1種最適恒溫條件下的萌發(fā)進(jìn)程

2.3 GA3和6-BA對(duì)新鮮光滑高粱泡種子休眠解除和萌發(fā)的影響

不同濃度的GA3和6-BA溶液處理的最終平均萌發(fā)率與對(duì)照相比，均沒有顯著性差異(p>0.05,圖3)。

2.4 冷濕層積處理對(duì)光滑高粱泡種子休眠解除和萌發(fā)的影響

冷濕層積處理能夠在一定程度上促進(jìn)光滑高粱泡種子休眠的解除及其萌發(fā)(表1)。隨著冷濕層積處理時(shí)間的延長，光滑高粱泡種子在10 ℃和15 ℃條件下的最終平均萌發(fā)率有增加趨勢(shì)(p<0.05)，而對(duì)其他恒溫條件下的最終平均萌發(fā)率則沒有顯著性影響(p>0.05,表1)。冷濕層積6周的光滑高粱泡種子在15 ℃條件下達(dá)到最高平均萌發(fā)率，為(55.5±5.9)%(表1)。

注：萌發(fā)溫度為20 ℃，每天12 h光照/12 h黑暗交替光照，PPFD=121 μmol/(m·s)。標(biāo)有相同小寫字母的數(shù)據(jù)間無顯著性差異(p=0.05)。圖3 GA3(A)和6-BA(B)溶液處理對(duì)新鮮光滑高粱泡種子休眠解除和萌發(fā)的影響

3 結(jié)論與討論

目前，關(guān)于懸鉤子屬植物種子休眠與萌發(fā)的研究結(jié)果存在很大差異。張春紅等[19]用GA3溶液處理黑莓Kiowa種子效果不明顯，而低溫層積處理則能夠有效地促進(jìn)其休眠解除和萌發(fā)。這與我們?cè)诠饣吡慌莘N子休眠解除和萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中所得的結(jié)果相類似。然而，龔娜等[20]卻發(fā)現(xiàn)冷濕層積處理對(duì)黑莓和樹莓早紅種子休眠解除和萌發(fā)沒有促進(jìn)作用。這或許是因?yàn)榉N或品種不同所致，黑莓和樹莓是懸鉤子屬多種植物的統(tǒng)稱，并且已人工培育出多個(gè)品種[21]，而兩篇文獻(xiàn)中均未標(biāo)明相應(yīng)的拉丁學(xué)名；另外，即使同種植物種子，其休眠的有無及休眠原因或休眠類型也可能存在差異。同種植物種子中可能有些種子有休眠，有些種子無休眠[1]；并且，同種植物種子中也可能存在多種休眠類型[22-23]，如心葉椴(TiliacordataMill.)種子中有些是復(fù)合休眠，有些是生理休眠[23]。

根據(jù)恒溫條件下的初始萌發(fā)和冷濕層積處理試驗(yàn)結(jié)果，以及Baskin等[1]的種子休眠分類系統(tǒng)，新鮮光滑高粱泡種子應(yīng)該無物理休眠，即種皮(實(shí)為內(nèi)果皮)不限制透水透氣，并很可能具有淺生理休眠。冷濕層積處理能夠有效促進(jìn)其種子休眠的解除和萌發(fā)(表1)，然而2種外源植物激素(GA3和6-BA)處理卻無顯著效果(圖3)。淺生理休眠種子的休眠解除和萌發(fā)是能夠被GA促進(jìn)的[4]，但不同種子需要不同的處理濃度，本研究可能未能找到合適的處理濃度，6-BA對(duì)種子休眠解除和萌發(fā)的促進(jìn)同樣也依賴于濃度。

層積處理能夠促進(jìn)很多植物種子的休眠解除[24]，如黃櫨(Cotinuscoggygria)種子的復(fù)合休眠(物理休眠+生理休眠)[25]。在本研究中，冷濕層積處理也顯著促進(jìn)了光滑高粱泡種子的萌發(fā)，然而與Deng等[25]實(shí)驗(yàn)中冷濕層積顯著促進(jìn)了黃櫨種子在從低到高各溫度下的萌發(fā)有所不同，冷濕層積處理僅顯著提高了光滑高粱泡種子在10 ℃和15 ℃低溫下的萌發(fā)率，最終平均萌發(fā)率最高分別達(dá)到(42.5±9.2)%[未經(jīng)層積處理的對(duì)照組的平均萌發(fā)率為(1.5±0.5)%]和(55.5±5.9)%[未經(jīng)層積處理的對(duì)照組的平均萌發(fā)率為(20.0±5.0)%]，而對(duì)其在20 ℃及其以上較高溫度條件下的萌發(fā)未顯示出促進(jìn)作用(表1)。這或許是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中冷濕層積處理時(shí)間還不夠長，也或者是2種植物種子的休眠機(jī)制有所不同。

變溫處理可有效解除少數(shù)懸鉤子屬植物種子的休眠[17]。新鮮光滑高粱泡種子在15 ℃/25 ℃和20 ℃/30 ℃變溫條件下培養(yǎng)時(shí)未顯示出休眠特性，或者說2種變溫條件有效促進(jìn)了休眠的解除，最終平均萌發(fā)率均達(dá)95%以上(圖2)。

綜上所述，光滑高粱泡種子應(yīng)該屬于淺生理休眠類型，最佳休眠解除方法為在15 ℃/25 ℃變溫條件下處理20 d以上，其次為在4 ℃左右冷濕層積6周以上。