劉雅娟 劉啟林

[摘要] 目的 探討菏澤市2013～2017年手足口病流行病毒類型，為菏澤市手足口病疫情的防控和實施策略提供科學(xué)依據(jù)。 方法 2013～2017年菏澤市各縣區(qū)手足口病定點醫(yī)療單位收集的臨床診斷病例的糞便或肛拭子標本，提取病毒核酸，應(yīng)用實時熒光定量PCR進行病毒的核酸檢測；用描述性流行病學(xué)方法分析流行病學(xué)特征。 結(jié)果 2013～2017年共收集樣本2751份，其中陽性樣本2294份，陽性率為83.39%；EV71陽性樣本1111份，陽性率為40.39%；CA16陽性樣本387份，陽性率為14.08%；其他腸道病毒陽性樣本796分，陽性率為28.93%。2013年、2015年優(yōu)勢株為EV71；2014年優(yōu)勢株為CA16；2016、2017年以其他腸道病毒型為優(yōu)勢株。不同年齡組、性別、季節(jié)分布差異有顯著性（P<0.05）。各年手足口病毒型別分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 2013～2017年菏澤市手足口病流行病毒類型從高到低分別是EV71、其他腸道病毒和CA16。EV71是引起重癥病例的主要病原體。在高發(fā)季節(jié)前，應(yīng)加強托幼機構(gòu)及散居兒童的衛(wèi)生健康教育和防控力度，提前做好低幼兒童的疫苗宣傳及接種工作；強化手足口病監(jiān)測力度。

[關(guān)鍵詞] 手足口?。粚崟r熒光定量PCR；腸道病毒71型（EV71）；柯薩奇病毒A16型（CA16）；核酸

[中圖分類號] R446.5 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2018）22-0131-05

[Abstract] Objective To investigate the epidemic virus types of hand-foot-and-mouth disease（HFMD） in 2013-2017 in Heze to provide scientific evidence for the prevention and control and implementation strategy of the epidemic situation of HFMD in Heze. Methods Stool or specimens by means of a swab collected from regular medical organizations in every county and district of Heze from 2013 to 2017 were used to extract viral nucleic acid. Viral nucleic acid was tested using real-time fluorescence quantitative PCR. Epidemiological characteristics were analyzed using descriptive epidemiological method. Results 2751 specimens were collected from 2013 to 2017. Out of them， 2294（83.39%） were positive. 1111 （40.39%） were EV71-positive. 387 （14.08%） were CA16-positive. 796 （28.93%） were other-enterovirus positive. Dominant strain in 2013 and 2015 was EV71. Dominant strain in 2014 was CA16. Dominant strain in 2016 and 2017 was other enterovirus. The differences among subgroups of age， sex and season were significant （P<0.05）. The distributions of HFMD virus types in every year were statistically different（P<0.05）. Conclusion The most common HFMD virus type in Heze from 2013 to 2017 was EV71， followed by other enterovirus and CA16. EV71 was the main pathogen which caused severe cases. Before the high-occurrence season， the health education and prevention and control in nurseries and scattered children should be enhanced. The promotion of vaccines and vaccination in young children should be done previously. It is necessary to strengthen the monitoring of HFMD.

[Key words] Hand-foot-and-mouth disease； Real-time fluorescence quantitative PCR； Enterovirus 17 （EV71）； Coxsackie virus A16 （CA16）； Nucleic acid

手足口病（hand-foot-and-mouth disease，HFMD）是一種由多種腸道病毒引起的傳染病[1]，以5歲以下嬰幼兒的發(fā)病為主，可導(dǎo)致患兒發(fā)熱及手、足等身體多部位出現(xiàn)皰疹，部分患兒甚至?xí)霈F(xiàn)嚴重的并發(fā)癥，如心肌炎、神經(jīng)源性肺水腫等重癥，嚴重者可導(dǎo)致死亡[2]。在我國，手足口病的流行病原在2O世紀80年代前后以CA16病毒感染為主，90年代EV71病毒感染逐漸占主導(dǎo)地位[3]。2013年開始全國手足口病的病原出現(xiàn)以其他腸道病毒為主的現(xiàn)象[4]。為了進一步了解菏澤市手足口病的病毒型別，現(xiàn)收集，整理并分析2013～2017年菏澤市九個縣區(qū)手足口病診療定點單位共計2751例臨床診斷病例標本的病毒核酸檢測結(jié)果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

根據(jù)《手足口病預(yù)防控制指南（2009版）》[5]中病原學(xué)監(jiān)測要求，菏澤市各縣（區(qū)）疾控工作人員到手足口定點診療單位采集臨床診斷為手足口病的病例糞便或肛拭子，以衛(wèi)生部2010版《手足口病診療指南》為手足口病例的臨床診斷標準[6]。每縣（區(qū)）每月最少需采集5例首次就診的普通病例標本，當月縣（區(qū)）病例總數(shù)少于5例時全部采樣。所有重癥和死亡病例均需采樣。2013～2017年菏澤市九縣區(qū)共采集手足口臨床病例糞便或肛拭子標本2751份。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及處理 按照《手足口病預(yù)防控制指南（2009版）中病原學(xué)監(jiān)測要求，采集手足口病病例糞便或肛拭子標本，低溫保存并送檢。糞便標本取5 g加入含10%氯仿和玻璃珠的PBS提取液的離心管中，劇烈震蕩30 min，4℃ 3000 rpm離心30 min，取上清液待檢；肛拭子標本劇烈震蕩10 min后，棄去棉拭子，4℃ 3000 rpm離心30 min，取上清液待檢。處理完成的標本立即提取核酸或保存于-20℃。

1.2.2 儀器及試劑 Roche High Pure Viral RNA Kit提取試劑盒（瑞士Roche公司）；Enterovirus type71 real time RT-PCR kit，Coxsackievirus A16 real time RT-PCR kit熒光定量PCR試劑盒（中山達安基因股份有限公司）；實時熒光定量PCR儀（美國ABI，Step One Plus）。

1.2.3 病毒核酸檢測 采用Roche High Pure Viral RNA Kit提取標本病毒核酸，取標本200 μL，加400 μL應(yīng)用液混勻，室溫10 min；混合液加入過濾管，下接收集管，10000 rpm 離心15 s，棄收集管，換新收集管；加500 μL 試劑Inhibitor Removal Buffer，8000 rpm 離心1 min，棄收集管，換新收集管；加450 μL試劑Wash Buffer，8000 rpm 離心1 min， 棄收集管，換新收集管；再加450 μL試劑Wash Buffer，8000 rpm離心1 min，棄收集管，換新收集管，最后12000 rpm離心10 s，棄收集管，換1.5 mL的EP管；加50 μL的試劑Elution Buffer，室溫平衡1 min，用10000 rpm離心1 min，EP管中即為提取的RNA。Enterovirus type 71 real time RT-PCR kit、Coxsackievirus virus A16 real time RT-PCR kit熒光定量PCR試劑盒配制核酸反應(yīng)擴增體系，使用實時熒光定量PCR儀檢測。Real Time RT-PCR操作按試劑盒說明進行，反應(yīng)如下：50℃ 15 min，1個循環(huán)；95℃ 15 min，1個循環(huán)；94℃ 15 s→55℃ 45 s（收集熒光），40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，呈典型S型擴增曲線且Ct值≤38，則判斷為陽性；無典型S型擴增曲線或Ct值>38，則判斷為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用Micrsoft Excel 2003創(chuàng)建數(shù)據(jù)表；用描述性流行病學(xué)方法對檢測結(jié)果進行分析；用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，定性資料用率表示，組間比較用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 手足口病病毒學(xué)監(jiān)測結(jié)果

通過實時熒光定量PCR對2013～2017采集的手足口病病例樣本共2751份進行檢測，結(jié)果陽性標本2294份，陽性率為83.39%（2294/2751）。其中，檢出EV71、CA16、其他腸道病毒陽性分別為1111份、387份、其他腸道病毒陽性樣本796份，陽性率分別為40.39%（1111/2751）、14.07%（3872751）、28.95%（796/2751）。從年份進行比較，2013年共檢測樣本575份，陽性樣本499份，陽性率86.78%（499/575），病毒學(xué)監(jiān)測結(jié)果由高到低依次為EV71（65.22%，375/575）、其他腸道病毒（20.17%，116/575）和CA16（1.39%，8/575），顯示EV71為2013年優(yōu)勢病原體。2014年共檢測樣本533份，陽性樣本430份，陽性率80.68%（430/533），病毒學(xué)監(jiān)測結(jié)果由高到低依次為CA16（34.33%，183/533）、其他腸道病毒（23.45%，125/533）和EV71（22.89%，122/533），顯示2014年CA16病毒在菏澤市有小范圍暴發(fā)。2015年共檢測樣本580份，陽性樣本502份，陽性率86.55%（502/580），病毒學(xué)監(jiān)測結(jié)果為EV71（58.79%，341/580）、其他腸道病毒（26.38%，153/580）和CA16（1.38%，8/580），顯示2015菏澤市手足口病繼續(xù)以EV71為優(yōu)勢病原體。2016年共檢測樣本540份，陽性樣本474例，陽性率（87.78%，474/540），病毒學(xué)監(jiān)測結(jié)果由高到低依次為其他腸道病毒（39.07%，211/540）、CA16（29.81%，161/540）和EV71（18.89%，102/540）。2017年共檢測樣本526份，陽性樣本389例，陽性率74.37%（389/526），病毒學(xué)監(jiān)測結(jié)果由高到低依次為其他腸道病毒（36.52%，191/526）、EV71（32.70%，171/526 ）、CA16（5.16%，27/526）。顯示2016、2017年其他腸道病毒是引起菏澤市手足口病的優(yōu)勢病原體。各年份手足口的陽性率有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=52.862，P<0.001）。引起手足口病的病毒型別分布有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=694.390，P=0.000）。見表1。

2.2 月份分布

將檢測結(jié)果按發(fā)病月份分析，手足口病全年各月均有檢出，1月、2月發(fā)病構(gòu)成比較低，分別為2.98%（82/2751）、3.96%（109/2751），3月急增，發(fā)病構(gòu)成比為10.8%（297/2751），4～6月為高峰期，4月構(gòu)成比為13.7%（377/2751），5月構(gòu)成比為15.09%（415/2751），6月構(gòu)成比為10.18%（280/2751），7～12月呈緩慢下降趨勢，發(fā)病構(gòu)成比分別為6.87%（189/2751）、5.67%（156/2751）、4.47%（123/2751）、3.89%（107/2751）、3.56%（98/2751）、2.22%（61/2751）。見圖1。

2.3 性別、年齡分布

男女陽性標本比例為1.86：1，男1491份，女803份，陽性標本在不同性別的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.772，P=0.002）。從年齡結(jié)構(gòu)上看，1～歲組和2～歲組標本陽性率分別為89.10%（875/982）和86.41%（763/883）。其他年齡組感染概率較低，由高到低依次為：3～歲組81.28%（304/374）、0～歲組73.25%（115/157）、4～歲組70.88%（129/182）、5～歲及以上組62.43%（108/173），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=117.255，P=0.000）。

2.4 地區(qū)分布

從九縣區(qū)手足口檢測陽性率比較，不同縣區(qū)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=162.330，P=0.000）。鄄城陽性率最高，為93.11%（284/305），其次為定陶，陽性率為92.63%（289/312），最低的為曹縣，陽性率為64.92%（198/305）；從各縣區(qū)發(fā)病的病原型別來看，也存在統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=90.802，P=0.000），牡丹區(qū)EV71構(gòu)成比最高，為6.72%（185/2751）；成武縣其他腸道病毒構(gòu)成比最高，為4.03%（111/2751），定陶CA16構(gòu)成比最高，為2.94%（81/2751），見表3、圖2、圖3。

2.5 重癥病例檢測結(jié)果

在62例重癥患者（其中1例死亡）的標本中，55份檢出手足口病毒，陽性率為88.71%（55/62）。其中，EV71病毒陽性率為82.26%（51/62）；其他腸道病毒陽性率為4.84%（3/62）；CA16病毒陽性率為1.61%（1/62）。2013年重癥患者陽性15例，全部為EV71感染，陽性率為78.95%（15/19）；2014年重癥患者陽性12例，EV71陽性9例，陽性率為69.23%（9/13）；2015年重癥患者陽性22例，EV71陽性21例，陽性率為91.3%（21/22）；2016年無重癥患者；2017年重癥患者陽性6例，EV71陽性6例，陽性率為85.71%（6/7）。不同年份重癥陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=16.677，P=0.001）。見表4。

3 討論

通過對確診樣本的分析，結(jié)果表明2013～2017年菏澤市手足口病病毒優(yōu)勢株在不斷發(fā)生變化，從陽性樣本總量分析，EV71是引起菏澤市手足口的主要病毒型，2014年出現(xiàn)小規(guī)模的CA16的暴發(fā)，2016、2017這兩年其他腸道病毒替代EV71成為優(yōu)勢病毒株，并且，由其他腸道病毒引起的手足口病病例構(gòu)成比從2013年的23.2%（116/499），上升到2017年的49.01%（191/389），這與全國其他地市流行情況相類似：甘肅省2013～2016年手足口監(jiān)測結(jié)果表明，除了2014年以CA16為優(yōu)勢病毒株，其余3年都是以其他腸道病毒為主，每年流行的其他腸道病毒型別都在變化，主要是CA6、CA10和CA4[7]；2011～2014年河北省手足口病病原構(gòu)成，EV71和CA16感染所占比例總體上呈下降趨勢，其他腸道病毒所占比例總體上呈上升的趨勢[8]；2011～2015年廣州市手足口病流行特征分析，同樣在手足口的高發(fā)季節(jié)，EV71和CA16相比其他年份均出現(xiàn)下降，而其他腸道病毒所占比例呈現(xiàn)明顯上升[9]。腸道病毒A組中的CA6、CA10引起手足口病例的報道逐年增多[10]。由此判斷，其他腸道病毒可能成為未來引起菏澤市手足口病的優(yōu)勢病毒，因此在今后手足口病病原學(xué)監(jiān)測中加大開展其他腸道病毒的分型鑒定的力度，有效提高我市手足口病的預(yù)防、控制能力。

菏澤市地處山東省西南部，中緯度地區(qū)，屬暖熱帶季風(fēng)氣候。這種春季干燥多風(fēng)，夏季高溫多雨，冬寒夏熱，春暖秋涼的氣候特征，非常適宜腸道病毒等各種病原微生物的生長繁殖[11]，因而，菏澤市手足口病的發(fā)病高峰期均在春末夏初之際。3月初氣溫開始回升，3～6月的氣溫和空氣濕度為手足口病的傳播創(chuàng)造了適宜的環(huán)境，導(dǎo)致手足口病的高發(fā)[12]。提示，在高發(fā)的4～6月可嘗試將氣溫、濕度、氣壓等可能導(dǎo)致的手足口病激增的氣候條件作為預(yù)測的指標，同時加強本階段的監(jiān)測與防控，以防手足口病的暴發(fā)流行。

2013～2017年菏澤市2751例手足口病臨床診斷病例，按照性別和年齡分組，發(fā)現(xiàn)男童組和女童組比例為1.86：1，性別分布有統(tǒng)計學(xué)差異，男童的發(fā)病率高于女童，這與男孩的好動及與人頻繁接觸相關(guān)[13]。1～歲組和2～歲組手足口病發(fā)病人數(shù)高于其他年齡組，可能與該年齡段兒童的免疫機制尚未發(fā)育完全有關(guān)，這與其他研究相同[14]。在病毒學(xué)檢測方面，各縣區(qū)引起手足口的病毒型別有統(tǒng)計學(xué)差異。牡丹區(qū)EV71構(gòu)成比最高，成武縣其他腸道病毒構(gòu)成比最高，定陶縣CA16構(gòu)成比最高。各縣區(qū)標本陽性率之間也有統(tǒng)計學(xué)差異，鄄城標本陽性率最高，其次定陶，曹縣最低。各縣區(qū)出現(xiàn)的差異可能存在多方面的影響因素，可能與各縣區(qū)醫(yī)療衛(wèi)生條件、人口免疫現(xiàn)狀、病原體構(gòu)成變化等有關(guān)。2013～2017年菏澤市手足口病重癥病例主要由EV71引起，這與其他地市報道相一致[15]。這可能與EV71病毒感染性強，易引起神經(jīng)毒性，引發(fā)重癥[16]有關(guān)。

本研究為菏澤市針對性的開展手足口病的防治工作指明了方向，對未來手足口病病毒學(xué)流行趨勢的預(yù)測提供了有效的實驗室依據(jù)。同時，在未來的手足口病防治工作中應(yīng)重點加強托幼機構(gòu)、學(xué)校等人員流動性大且人口密集地區(qū)的手足口病衛(wèi)生知識宣傳，加大重點人群的防控力度，加大發(fā)病率高的縣區(qū)的流調(diào)工作力度，在高發(fā)季節(jié)密切關(guān)注氣候等影響條件的變化，及時開展應(yīng)對工作，同時加強接種手足口疫苗的宣傳工作，為適齡兒童接種手足口疫苗是預(yù)防手足口病最有效、最經(jīng)濟的手段。加強手足口病的病毒學(xué)監(jiān)測力度，為手足口的預(yù)防與流行做好研判。

[參考文獻]

[1] Xing W，Liao Q，Vibound C，et al. Hand，foot and mouth disease in China，2008-12：An epidemiological study[J]. The Lancet Infectious Diseases，2014，14（4）；308-318.

[2] 徐玉蘭，黃烈平，韓宜姚，等.手足口病患兒C-反應(yīng)蛋白變化與愈后相關(guān)性研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014，（11）：2832-2833.

[3] 王利花，李軍.手足口病的流行病學(xué)及病原學(xué)研究進展[J].中國衛(wèi)生事業(yè)管理，2010，264（6）：419-421.

[4] 隋美麗，李懿，劉新奎，等.手足口病流行病學(xué)、病原學(xué)及重癥化機制的研究進展[J].中國病原生物學(xué)雜志，2017，12（1）：92-96.

[5] 中華人民共和國中央人民政府.手足口病預(yù)防控制指南（2009）版[S].2009-06-04.

[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部.手足口病診療指南（2010）版[S].2010-04-20.

[7] 陳建華，張勇，武海卓，等.甘肅省2013-2016年手足口病病原學(xué)監(jiān)測分析[J].病毒學(xué)報，2017，33（4）：505-511.

[8] 劉瑩瑩，趙文娜，劉宏靈，等.2011-2014年河北省手足口病病原構(gòu)成及其他腸道病毒基因進化分析[J].中國病原生物學(xué)雜志，2016，11（11）：973-976，981.

[9] 劉靜雯，耿進妹.2011-2015年廣州市手足口病流行病學(xué)特征及病原學(xué)監(jiān)測分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2017，44（5）：772-777.

[10] 李靜，張婷，鄒文菁，等.2016年湖北省部分地區(qū)手足口病腸道病毒病原譜及柯薩奇病毒A6型和A10型基因特征分析[J].疾病監(jiān)測，2017，（6）：462-466.

[11] 劉立，韓紅濤，龐志釗，等.石家莊市氣象因素與手足口病流行的關(guān)系研究[J].手足口專欄，2013，16（1c）：326-328.

[12] 陳凡，周濤，陳嘉熠，等.成都市嬰幼兒輪狀病毒陽性率與氣象因素的關(guān)系探討[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，41（23）：4272-4274.

[13] 宋和.手足口病的流行病學(xué)特征及預(yù)防[J].中國醫(yī)藥指南，2012，10（34）：495-496.

[14] GAO LD，HU SX，ZHANG H，et al. Correlation analysis of EV71 detection and severity in hand，foot，and mouth disease in the Hunan province of China[J]. PLOS One，2014，9（6）：el00003.

[15] 鄧麗珊.手足口重癥病例EV71檢出情況及病原學(xué)分析[J].現(xiàn)代診斷與治療，2015，26（9）：2072-2073.

[16] 秦偉，常宏偉，曹洪娟，等.2009-2014年安徽省六安市手足口病流行病學(xué)及病原學(xué)特征分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2016，2（1）：358-361.

（收稿日期：2018-03-27）