韋元琪，錢 旭，雍曉雨,2，賈紅華,2,周 華，蔡 恒

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800;2.南京工業(yè)大學(xué) 生物能源研究所，江蘇 南京 211800)

在現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中，濃醪發(fā)酵在生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越受到關(guān)注[1]。例如，越來越多的以生產(chǎn)醬油、面醬、辣醬等食品的生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)后期常采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵[2]，然而，在高鹽條件下發(fā)酵，會導(dǎo)致發(fā)酵菌株細(xì)胞內(nèi)水活度降低、細(xì)胞質(zhì)的組成發(fā)生變化并伴隨細(xì)胞膜損傷等，從而抑制了發(fā)酵的后續(xù)工藝[3-4]

van der Sluis等[5]在醬油釀造過程中通過后期添加耐鹽酵母進(jìn)行高鹽稀態(tài)發(fā)酵，顯著改善了醬油的風(fēng)味。謝韓等[6]將含有耐鹽酵母的生醬油接入低鹽固態(tài)原油中再發(fā)酵1個月，檢測發(fā)現(xiàn)，醬油中還原糖含量下降30%，乙醇含量上升到0.50%～0.86%，醬油明顯變得酯香濃郁、鮮甜適口、口味綿長。因此，從自然界中篩選出具有耐鹽性能的優(yōu)良酵母具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景[7]

Na+在高濃度條件下對細(xì)胞具有毒害作用，可致細(xì)胞死亡[8]，而耐鹽酵母的高鹽耐受性的機(jī)制已得到廣泛研究。有研究指出，耐鹽酵母在高鹽條件下會合成一些兼容性物質(zhì)，如海藻糖，或提高一些酶的活力，以此來抵抗外界不良環(huán)境[9]。其中，海藻糖具有“生命之糖”的美稱，它能增加生物膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使耐鹽酵母能夠抵抗外界不利環(huán)境。Hottlgerh等[10]認(rèn)為海藻糖是通過與蛋白表面親水基團(tuán)結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)的暴露，進(jìn)而抑制熱激所致的蛋白質(zhì)非特異性凝聚，達(dá)到增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的效果。Simola等[11]認(rèn)為海藻糖可與變性蛋白結(jié)合，維持其半折疊狀態(tài)，協(xié)助Hsp104(熱休克蛋白104)重新折疊變性蛋白，賦予耐鹽酵母對高滲環(huán)境的耐受性。此外，ATPase的活性也是衡量酵母是否具有耐鹽性的1個指標(biāo)。ATPase是一種重要的膜蛋白，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，主要功能是催化細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)水解并伴隨將胞內(nèi)H+泵出胞外，建立跨膜電化學(xué)梯度，用以驅(qū)動菌體生長所需營養(yǎng)物質(zhì)的主動運(yùn)輸，對維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要的作用[12]。此外，膜上一些有毒離子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如ENA1-5p)也需要ATP的水解提供能量才能發(fā)揮作用，因此，ATPase活性的大小對酵母耐鹽性也具有一定的作用。細(xì)胞抗高鹽的機(jī)制研究雖然取得了諸多成果，但仍有一些不明之處，例如，液泡的區(qū)隔化作用是一個大液泡還是分裂成幾個小液泡耐鹽效果更好[13]？是海藻糖還是海藻糖合成途徑中關(guān)鍵基因TPS1對酵母的耐鹽性影響更大[14]？

本研究中，筆者從酒曲中篩選出1株具有高鹽耐受性的酵母菌株，采用26S rDNA對其進(jìn)行分子鑒定，并對其生物學(xué)基本特性及耐鹽性進(jìn)行初步研究，以期為后續(xù)酵母細(xì)胞耐鹽機(jī)制的研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

酒曲由南京洋河酒廠提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物有限公司。

YPD培養(yǎng)基：酵母膏 5 g/L,蛋白胨 10 g/L,葡萄糖 20 g/L，自然pH,去離子水定容至1 000 mL，滅菌待用。

鹽濃度梯度培養(yǎng)基：共設(shè)置3個鹽濃度梯度，分別為含1.0、1.2和1.4 mol/L NaCl的YPD培養(yǎng)基。

氯化三苯四唑(TTC)顯色培養(yǎng)基：上層培養(yǎng)基為TTC 0.005 g/L，葡萄糖0.05 g/L，瓊脂0.15 g/L，調(diào)pH至6.0；下層培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖200 g/L，蛋白胨20 g/L，(NH4)2SO41 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，pH自然，滅菌待用。

1.2 篩選方法

1.2.1 預(yù)處理與富集

樣品的預(yù)處理：稱取10 g酒曲樣品，加入50 mL 裝有適量滅菌玻璃珠的無菌水中，200 r/min處理6 h混勻樣品。

酵母菌的富集：取2 mL樣品懸液接入酵母富集培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)過夜，之后采用梯度培養(yǎng)，最終在NaCl為1.4 mol/L的條件下30 ℃、180 r/min培養(yǎng)，以富集其中的耐鹽酵母。

1.2.2 耐鹽酵母的一級篩選

將菌株富集液逐級接種于1.0、1.2、1.4和1.6 mol/L NaCl 液體培養(yǎng)基中，在1.6 mol/L條件下，其生長受到顯著抑制，所以選擇1.4 mol/L為篩選條件，并在該條件下培養(yǎng)過夜后將菌懸液稀釋涂布于1.4 mol/L NaCl的YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)72 h，待長出菌落后倒入TTC上層培養(yǎng)基，避光放置2～3 h。比較各菌落顏色的深淺，顏色呈深紅色的說明具有較好的呼吸能力。挑選顯色明顯的酵母菌落，多次劃線分離純化后甘油管保存[15]。

1.2.3 二級篩選

將一級篩選獲得的酵母菌分別接入帶有杜氏小管的不同YPD液體試管中，分別在12、24、36和48 h 時觀察杜氏小管中的產(chǎn)氣情況，產(chǎn)氣越多說明菌株生長越旺盛。

1.2.4 三級篩選

將二級篩選獲得的18株酵母過夜培養(yǎng)后，按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后，用生物傳感儀測量發(fā)酵液中的殘?zhí)橇?，根?jù)殘?zhí)橇康亩嗌賮砼卸òl(fā)酵的好壞。

1.3 酵母的鑒定

1.3.1 形態(tài)與培養(yǎng)特征

菌株接種到 YPD 液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)過夜，制水浸片于顯微鏡下觀察酵母細(xì)胞形態(tài)。同時將該菌株在YPD瓊脂培養(yǎng)基上涂布，30 ℃培養(yǎng) 3～4 d后，觀察其菌落形態(tài)。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

使用TaKaRa公司的Yeast DNA Kit 試劑盒提取酵母的基因組DNA，利用通用引物(上游:5′-T-C-C-T-C-T-A-A-A-T-G-A-C-C-A-A-G-T-T-T-G-3′，下游:5′ -GG-A-A-G-G-G-A-T-G-T-A-T-T-T-A-T-T-A-G -3′)進(jìn)行26S rDNA基因的PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，最后將測序結(jié)果進(jìn)行 BLAST比對，并用MEGA5軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.4 酵母生物學(xué)特性研究

1.4.1 生長曲線的測定

以2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于普通YPD培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，每隔2 h取1次樣，以蒸餾水做空白對照，測量OD600，每組3次平行實驗。以時間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制目標(biāo)菌株生長曲線。

1.4.2 溫度對酵母菌生長的影響

以2%的接種量接種于普通YPD培養(yǎng)基中，分別在25、28、30、32和35 ℃條件下，180 r/min培養(yǎng)過夜后測量OD600。以時間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.4.3 pH對酵母菌生長的影響

以2%的接種量接種于普通YPD培養(yǎng)基中，分別在pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0條件下，180 r/min培養(yǎng)過夜后測量OD600。以時間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.5 測定方法

1.5.1 發(fā)酵液中殘?zhí)橇康臏y定

利用SBA-40E型生物傳感儀(山東省科學(xué)院生物研究所) 進(jìn)行測定，根據(jù)操作說明，用進(jìn)樣針對發(fā)酵液進(jìn)行進(jìn)樣，待讀數(shù)穩(wěn)定后直接讀數(shù)。

1.5.2 胞內(nèi)海藻糖含量的測定

參照文獻(xiàn)[16]方法繪制出海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果為y=0.040 6x-0.007 4,R2=0.998 7，并根據(jù)這一曲線測出待測樣品中海藻糖的含量。

1.5.3 酵母細(xì)胞質(zhì)膜ATPase活性的測定

1)無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。參照文獻(xiàn)[17]，采用無機(jī)磷標(biāo)曲法測定ATPase的活性。首先測出標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果為y=0.737 2x+0.017 5,R2=0.997 8。

2) 質(zhì)膜提取物的制備。參照文獻(xiàn)[18-19]中的方法對酵母質(zhì)膜進(jìn)行提取以及膜蛋白含量的測定。

3) 酶活測定。反應(yīng)體系為1 mL，50 mmol/L MES緩沖液(用Tris調(diào)pH為5.5)(10 mmol/L MgSO4、50 mmol/L KCl、5 mmol/L疊氮化鈉、0.2 mmol/L鉬酸銨、100 mmol/L KNO3，加入0.5 mL 質(zhì)膜提取物)。體系于30 ℃恒溫水浴保溫6 min，然后加入底物 ATP 2 mL(使其在反應(yīng)體系中的濃度為2 mol/L)啟動酶促反應(yīng)，加入終濃度為4 mmol/L 的 ATP啟動酶促反應(yīng)，反應(yīng)10 min。后加入2 mL 含0.5% SDS和0.5% 鉬酸銨的2% H2SO4溶液以終止酶促反應(yīng)。然后離心取上清，加入40 μL 10% 維生素C以還原磷鉬酸，30 ℃中保溫5 min后，于750 nm 波長處測定以定量酶促反應(yīng)釋放出的無機(jī)磷光密度。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐鹽酵母的篩選

2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)是一種顯色劑，它可以與酵母的代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)，因此，可以通過TTC反應(yīng)后顏色的深淺判斷酵母中呼吸酶的活力。首先，通過NaCl濃度梯度富集培養(yǎng)和TTC的顯色反應(yīng)(一級篩選)，共篩選出18株顏色較紅、菌落較大的酵母菌株；接著，將這18株菌株進(jìn)行杜氏小管產(chǎn)氣實驗(二級篩選)，結(jié)果見表1。

由表1可知:18株待選酵母菌株中，有6株產(chǎn)氣能力較強(qiáng)，即生長較快，分別為14號、17號、18號、23號、49號和58號，將這6株菌株純化后保存待用。

表1 產(chǎn)氣實驗結(jié)果

注：“+”是指杜氏小管的1/4容量，“-”是指沒有氣體產(chǎn)生，“+(-)”是指不足杜氏小管1/4容量。

2.2 發(fā)酵試驗

將二級篩選獲得的6株酵母菌株進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵實驗，測量其發(fā)酵后的殘?zhí)?，挑選出葡萄糖利用效率最高且發(fā)酵性能最佳的酵母菌株，結(jié)果見表2。

表2 發(fā)酵液中的殘?zhí)橇?/p>

由表2可知：搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛茸畹偷氖蔷闣58(0.46 mg/mL)，說明其葡萄糖利用率最高，發(fā)酵性能最好，其葡萄糖利用率比菌株W18高69%。因此，本研究選取菌株W58進(jìn)行種屬鑒定及生物學(xué)特性研究。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察以及鏡檢結(jié)果

將菌株W58稀釋涂布于普通YPD平板，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，觀察菌落形態(tài)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株W58的菌落呈乳白色、毛絨狀，在顯微鏡下觀察該菌株呈橢圓型。

圖1 酵母菌株W58的平板菌落形態(tài)觀察及鏡檢結(jié)果Fig.1 Morphological observation and microscopic examination results of strain W58

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

在真菌的鑒定工作中，對菌株的26S rDNA基因進(jìn)行測序和比對分析是一種常用的分子鑒定方法，其中用于擴(kuò)增26S rDNA 基因片段的PCR引物對是根據(jù)真菌26S核糖體亞基編碼基因的保守區(qū)域設(shè)計的。對菌株W58進(jìn)行26S rDNA基因進(jìn)行測序，并將其26S rDNA 基因序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，下載相關(guān)的基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：菌株W58與庫德里阿茲威氏畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)具有最高的同源性，同源性達(dá)到97%，因此將其鑒定并命名為PichiakudriavzeviiW58。

圖2 菌株W58基于26S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on partial 26S rDNA gene sequences of W58 and reference strains

2.4 生物學(xué)特性

2.4.1 生長曲線

測定菌株W58生長性能并繪制生長曲線，結(jié)果見圖3。

由圖3可知：菌株W58的生長周期分為明顯的延滯期、對數(shù)期、平穩(wěn)期和衰亡期。該菌大約有4 h的延滯期，在這一時期細(xì)胞數(shù)無明顯變化；4 h之后進(jìn)入對數(shù)期，細(xì)胞開始快速生長，細(xì)胞數(shù)呈指數(shù)增長；12 h后細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期，在這一時期細(xì)胞數(shù)量變化不大；28 h后，細(xì)胞開始進(jìn)入衰亡期，細(xì)胞數(shù)目開始下降。這一特性與大部分已報道酵母的生長特性相似。

圖3 菌株W58的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain W58

2.4.2 溫度對酵母菌生長的影響

溫度在酵母的生產(chǎn)及發(fā)酵過程中有著至關(guān)重要的作用，其影響具體表現(xiàn)在對細(xì)胞內(nèi)酶活性的影響、對細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜流動性的影響以及對物質(zhì)溶解度的影響等方面。酵母的活動最適溫度為 20～30 ℃。當(dāng)溫度達(dá)到 20 ℃時，酵母菌的繁殖速度加快，在 30 ℃時達(dá)到最大值，而當(dāng)溫度繼續(xù)升高達(dá)到 35 ℃時，其繁殖速度迅速下降，酵母菌呈疲憊狀態(tài)，酒精發(fā)酵有停止的危險[20]。考察不同溫度下培養(yǎng)酵母的OD600，結(jié)果見圖4。

由圖4可知：當(dāng)溫度低于30 ℃時，酵母菌的生長速度隨著溫度的升高而增長；當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時，其生長值達(dá)到最大；溫度繼續(xù)升高之后，生長又出現(xiàn)下降的趨勢。

圖4 溫度對菌株W58生長的影響Fig.4 Effect of temperature on the growth of strain W58

2.4.3 pH對酵母菌生長的影響

酵母細(xì)胞的生長和胞內(nèi)酶促反應(yīng)都需要在一定的 pH 環(huán)境中進(jìn)行，pH過高或過低都會影響酵母細(xì)胞膜所帶電荷狀態(tài)，使酵母生長代謝受阻。在不同pH條件下，將菌株W58過夜培養(yǎng)，結(jié)果見圖5。

由圖5可知：在pH<6.0的培養(yǎng)條件下，隨著pH的升高，酵母菌的生長速度逐漸加快；而在pH>6.0的培養(yǎng)條件下，酵母菌的生長開始出現(xiàn)下降的趨勢。因此pH 6.0為菌株W58的最適生長pH。

圖5 pH對菌株W58生長的影響Fig.5 Effect of different pH on the growth of strain W58

2.5 海藻糖含量的測定

許多生物在脅迫環(huán)境下所表現(xiàn)出的耐受力與胞內(nèi)海藻糖的含量有直接的關(guān)系，也是釀酒酵母在各種環(huán)境壓力下的生存保護(hù)劑。陳麗君等[21]以存活率為指標(biāo)，考察了不同時期不同釀酒酵母對多種不良環(huán)境的耐受性，并且測定了不同時期菌體胞內(nèi)海藻糖含量，結(jié)果表明胞內(nèi)海藻糖含量與酵母的耐受性之間存在一定的相關(guān)性，海藻糖含量越高，酵母的環(huán)境耐受性越好。所以筆者在高滲即1.4 mol/L NaCl條件下，分別測定其胞內(nèi)海藻糖含量，考察所篩耐鹽菌和不耐鹽的對照菌畢赤酵母KM71對鹽的耐受性，結(jié)果見圖6。

圖6 高滲脅迫下菌株W58胞內(nèi)海藻糖含量Fig.6 Effects of salt concentration on trehalose content in strain W58

由圖6可以看出:在普通YPD的培養(yǎng)條件下，2種酵母菌株胞內(nèi)積累的海藻糖含量較為接近，而在高滲條件下，耐鹽的庫德里阿茲威氏畢赤酵母W58能積累更高的海藻糖，其胞內(nèi)海藻糖含量能達(dá)到0.02 g/L，比對照菌KM71高出28.6%。Herrera等[22]研究發(fā)現(xiàn)漢遜酵母作為耐鹽酵母，它在高滲的外界環(huán)境能刺激海藻糖合成途徑增加海藻糖的積累來抵抗外界環(huán)境，本實驗所篩菌與之相符，說明在一些極端環(huán)境中，酵母能積累更多的海藻糖這種兼容性物質(zhì)來作為滲透保護(hù)劑維持菌株的正常生長和生理代謝。

2.6 ATPase酶活的測定

質(zhì)膜H+-ATPase是細(xì)胞生命活動過程中的主宰酶,對細(xì)胞生長、發(fā)育以及各種環(huán)境變化都有影響。質(zhì)膜 H+-ATPase為“P-型”，主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子出細(xì)胞產(chǎn)生跨質(zhì)膜電化學(xué)梯度，激發(fā)溶質(zhì)的次級轉(zhuǎn)運(yùn)。這種酶活性的調(diào)節(jié)與耐鹽性之間存在一定的聯(lián)系[23]，楊穎麗等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在過鹽脅迫下，小麥根質(zhì)膜ATPase酶活性出現(xiàn)明顯的下降?；谥暗囊恍┭芯浚疾觳煌}條件下對ATPase活性進(jìn)行測定，結(jié)果見圖7。

圖7 高滲條件下ATPase活性變化Fig.7 Effects of salt concentration on plasma membrane ATPase activities of yeast

由圖7可知：在正常生理生長狀態(tài)下，對照菌(KM71)和待試菌株(W58)的ATPase酶活差異較?。坏诟邼B條件下對照菌的ATPase活性顯著下降，僅為耐鹽菌W58的1/3左右，這與文獻(xiàn)[23]報道的ATPase參與了酵母的耐鹽性相一致。較高的ATPase活性就能較快地水解ATP提供能量，形成質(zhì)子梯度，與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共同作用，將有毒陽離子運(yùn)出，從而提高酵母的耐鹽性。

3 結(jié)論

本研究通過多級篩選，分離獲得1株發(fā)酵性能及耐鹽性能較好的酵母菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)檢測，將其鑒定為1株庫德里阿茲威氏畢赤酵母，并命名為PichiakudriavzeviiW58，該菌株的最適生長溫度和pH分別為30 ℃和6.0。在高滲條件下培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，菌株W58能通過在胞內(nèi)積累海藻糖以及維持一定的ATPase活性來抵抗外界環(huán)境壓力。