孫鋒，肖團(tuán)有，陳輝，李玉英

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405 2.珠海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 珠海 519000 3.廣州市紅十字會醫(yī)院，廣東 廣州 510220

內(nèi)痔為臨床常見病，多發(fā)病。迄今為主，肛墊下移的機制尚未明確，引起內(nèi)痔發(fā)生的機理亦尚未清楚。目前，利用分子生物學(xué)研究機理的方法已逐漸成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的主流，而運用中醫(yī)中藥治療痔病更是經(jīng)過了幾千年的臨床驗證。因此，本研究在現(xiàn)代分子生物學(xué)層面，觀察Ⅲ度脫垂性內(nèi)痔患者服用補中益氣湯及草木犀浸液片與單純服用草木犀浸液片1周后，其內(nèi)痔組織中Fibulin-5mRNA及蛋白表達(dá)的變化，以評估補中益氣湯對Ⅲ度脫垂性內(nèi)痔組織中Fibulin-5表達(dá)的影響，以期探究內(nèi)痔的發(fā)生機理，為后續(xù)研究提供參考。

1 臨床資料

1.1 一般資料 所有病例均為2014年9月—2016年3月廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肛腸科門診患者。均符合脾虛氣陷型、Ⅲ度脫垂性內(nèi)痔患者共59例，其中男44例，女15例；年齡30～61歲，平均(42.7±9.357)歲；病程6月～25年，平均(4.14±5.675)年。根據(jù)就診順序按照隨機數(shù)字表法分為3組：治療組(A組)20例、對照組(B組)20例、空白組(C組)19例。A組男16例，女4例；年齡(42.20±8.64)歲；病程(4.37±5.90)年。B組男15例，女5例；年齡(43.70±8.98)歲；病程(3.35±4.57)年。C組男14例，女5例；年齡(42.26±10.9)歲；病程(4.3±6.62)年。3組患者性別、年齡、病程等比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。療程結(jié)束后，收?、蠖让摯剐詢?nèi)痔治療后的肛墊組織標(biāo)本30例(均為自愿要求住院行手術(shù)治療者，其余患者繼續(xù)藥物治療或治愈而脫落)，分別來源于A、B、C組患者，再對應(yīng)分組為A1、B1、C1組各10例。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參考《痔臨床診治指南(2006版)》[1]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：Ⅲ度內(nèi)痔可有便血，排便或久站及咳嗽、勞累、負(fù)重時有痔脫出，需用手還納。脾虛氣陷型：腫物脫出肛外，不易復(fù)位，肛門墜脹，排便乏力，便血色淡；面色少華，頭暈神疲，食少乏力，少氣懶言；舌淡胖，苔薄白，脈細(xì)弱。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)中Ⅲ度內(nèi)痔且中醫(yī)證型為脾虛氣陷者；年齡大于16周歲，小于65周歲，且病程≥6月者；入組前1周均未服用任何藥物者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)者；妊娠期或哺乳期婦女；對服用本藥過敏，或伴嚴(yán)重不良反應(yīng)，不宜繼續(xù)本研究治療者；合并嚴(yán)重原發(fā)性慢性疾病、傳染病患者；精神病患者、無自主能力、依從性差，無法配合治療者；嚴(yán)重腎功能損害者；由于收集資料不全或無法判斷療效等影響實驗結(jié)果者；治療或觀察期間自行退出、脫落及失訪者。

2 治療方法

2.1 A組 予草木犀流浸液片(日本·生晃榮養(yǎng)藥品株式會社，注冊證號H20160144)口服，每次1 600 mg，每天3次。聯(lián)合補中益氣湯治療。處方：黃芪20 g，黨參、陳皮各9 g，升麻15 g，當(dāng)歸、白術(shù)各12 g，柴胡、甘草各6 g。每天1劑，水煎，每次100 mL，每天3次，飯后溫服。

2.2 B組 僅予草木犀流浸液片口服，每次1 600 mg，每天3次。

2.3 C組 僅作空白對照，不用藥物治療。

3組均以1周為1療程，共治療1療程。療程停止后第2天，根據(jù)患者意愿行手術(shù)治療，收集肛墊組織標(biāo)本再分組后進(jìn)行免疫蛋白印跡法(Western blot)檢測Fibulin-5蛋白，Real-time PCR檢測Fibulin-5 mRNA表達(dá)。

3 觀察項目與統(tǒng)計學(xué)方法

3.1 主要實驗材料與主要設(shè)備 Western blot器；配膠試劑盒：P0012A；一抗稀釋液：P0023A；一抗、二抗去除液：P0025A；Western轉(zhuǎn)膜液：P0021A；RIPA裂解液：P0013A(以上試劑均購自碧云天生物技術(shù)研究所，江蘇海門)。二抗：Anti-Rabbit IgG(H&L)HRP Conjugate，W4011；Anti-Mouse IgG HRP Conjugate，W4021(購自promega生物技術(shù)有限公司)。配膠、電泳、轉(zhuǎn)膜相關(guān)器械均為Bio-Rad公司，移液槍(Eppendorf)，電泳儀(Tanon，EPS300)，紫外透射分析儀(Hema，UV-3A)，冷凍高速離心機(Hema，TGL-16R)，基因擴增儀(Hema，Hema9600)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇環(huán)宇科學(xué)儀器，HH-4)，Real-time Quantitative PCR(applied biosystems，StepOnePlus)，化學(xué)發(fā)光成像分析儀，GE ImageQuant LAS 4000。PCR相關(guān)試劑耗材：PCR儀(Thermo Scientific公司，PikoReal 96 Real-Time PCR System)。Trizol(Invitrogen公司，#15596-026.RT試劑盒，Thermo Scientific公司，#K1622)；定量PCR試劑盒(Thermo Scientific 公司，#K0251)；Anti-Fibulin 5 antibody[1G6A4]。引物序列：β-Actin-R：CTCCTTAATGTCACGCACGAT，F(xiàn)ibulin-5-F： TCGCTATGGTTACTGCCAGC， Fibulin-5-R： AAGAGCC GTAGGTGTTGACG，GAPDH-H-R：GCCCAATACGACCAAATCC。

3.2 標(biāo)本采集 在無菌條件下，取行直腸黏膜環(huán)切術(shù)后患者的肛墊組織標(biāo)本，并將其放入預(yù)冷至4℃的醫(yī)用生理鹽水中進(jìn)行快速清洗，切割出2份約0.5 cm長的標(biāo)本，分別裝入含RNAlater及含多聚甲醛的EP管中固定后，然后將固定在RNAlater中的標(biāo)本及固定在多聚甲醛中的標(biāo)本分別置于-80℃冰箱及4℃冰箱內(nèi)低溫保存。

3.3 檢測指標(biāo) ①采用免疫蛋白印跡法(Western blot)檢測Fibulin-5蛋白；②Real-time PCR檢測Fibulin-5 mRNA表達(dá)。

3.4 統(tǒng)計學(xué)方法 將所收集的數(shù)據(jù)建立原始數(shù)據(jù)庫，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。首先對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，對于符合正態(tài)性檢驗與方差齊性的計量資料采用單因素方差分析，配對t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析；對于不符合正態(tài)性檢驗，方差不齊或無法轉(zhuǎn)換成方差齊性的計量資料則采用兩相關(guān)樣本非參數(shù)秩和檢驗、多獨立樣本非參數(shù)秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料則運用χ2檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析；等級資料運用多獨立樣本非參數(shù)K-W檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 qPCR相對定量結(jié)果 見圖1、圖2。從Fibulin-5溶解曲線、β-Actin溶解曲線顯示出只有單峰且信號特異，說明引物是特異的，無雜帶、無雜信號。

4.2 3組Fibulin-5 mRNA表達(dá)水平比較 見表1。3組間內(nèi)痔組織標(biāo)本中Fibulin-5 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。組間的兩兩比較：A1組Fibulin-5 mRNA表達(dá)水平高于B1組(P＜0.05)；A1組Fibulin-5 mRNA表達(dá)水平高于C1組(P＜0.05)；B1組Fibulin-5 mRNA表達(dá)水平高于C1組(P＜0.05)。提示3組中內(nèi)痔組織標(biāo)本中Fibulin-5 mRNA表達(dá)水平可能為A1＞B1＞C1。

4.3 3組Fibulin-5蛋白表達(dá)水平比較 見表2。3組間內(nèi)痔組織標(biāo)本中Fibulin-5蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.581，P=0.000＜0.05)。組間的兩兩比較：A1組Fibulin-5蛋白表達(dá)水平高于B1組(P＜0.05)；A1組Fibulin-5蛋白表達(dá)水平高于C1組(P＜0.05)；B1組與C1組Fibulin-5蛋白表達(dá)水平相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。提示3組中內(nèi)痔組織標(biāo)本中Fibulin-5蛋白表達(dá)水平可能為A1＞B1=C1。

4.4 3組Fibulin-5蛋白條帶結(jié)果 見圖3。從3組標(biāo)本中Fibulin-5蛋白條帶可以發(fā)現(xiàn)，A1組中Fibulin-5蛋白表達(dá)最強且集中。

圖1 Fibulin-5溶解曲線

圖2 β-Actin溶解曲線

表1 3組Fibulin-5 mRNA表達(dá)水平比較(±s)

表1 3組Fibulin-5 mRNA表達(dá)水平比較(±s)

分組A 1 B 1 C 1 n P值1 0 1 0 1 0 A 1 v s B 1 A 1 v s C 1 B 1 v s C 1 F i b u l i n-5 m R N A 0.7 6 0±0.1 2 6 0.6 2 0±0.0 7 9 0.4 3 0±0.1 1 6 0.0 0 8 0.0 0 0 0.0 0 1

表2 3組Fibulin-5蛋白表達(dá)水平比較(±s)

表2 3組Fibulin-5蛋白表達(dá)水平比較(±s)

分組A 1 B 1 C 1 n P值1 0 1 0 1 0 A 1 v s B 1 A 1 v s C 1 B 1 v s C 1 F i b u l i n-5蛋白2.1 9 0±0.1 6 6 1.9 6 0±0.1 5 8 1.8 2 0±0.1 7 5 0.0 0 5 0.0 0 0 0.0 7 1

5 討論

Fibulin-5蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)成分，是彈性纖維的組成成分。它具有Fibulin家族的特有結(jié)構(gòu)，也有自己特殊的結(jié)構(gòu)，能與整合素結(jié)合的RGD模序(Arg-Gly-Asp，integrin-binding motif)，這個基序能介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附，與細(xì)胞表面的整合素α5β1，α4β1，αvβ3，αvβ5 和 α9β1 相結(jié)合，將彈性蛋白原錨定于細(xì)胞表面，這對形成彈性纖維十分關(guān)鍵。研究表明，F(xiàn)ibulin-5基因敲除的小鼠皮膚的成熟彈性纖維明顯減少，并且介導(dǎo)Fibulin-5基因后發(fā)現(xiàn)彈性纖維數(shù)量增加，密度增高。表明Fibulin-5 mRNA與Fibulin-5具有正相關(guān)的用[2]。另有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ibulin-5可上調(diào)TIMP-3和TIMP-1和下調(diào)MMPs系的表達(dá)[3]。說明Fibulin-5可通過調(diào)節(jié)這些基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑細(xì)胞外基質(zhì)成分而影響彈性纖維的結(jié)構(gòu)功能。Fibulin-5不僅具有指引彈性蛋白的功能，而且可以調(diào)節(jié)彈性蛋白與交聯(lián)酶之間的相互作用，調(diào)節(jié)彈性纖維細(xì)胞之間的連接，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)彈性纖維成分合成成熟的彈性纖維功能。

圖3 3組Fibulin-5蛋白條帶

Fibulin-5不僅作用于彈性纖維的合成，還可以抑制新生血管的生成，降低微血管密度。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ibulin-5可顯著抑制小鼠體內(nèi)的新生血管的生成，且可以減低腫瘤組織中的血管密度[4]。目前Fibulin-5是公認(rèn)的內(nèi)源性新生血管的抑制劑。它抑制新生血管的機制可能有以下兩種：①血管內(nèi)皮細(xì)胞中血小板反應(yīng)素1(thrombospondin1，TSP-1)是抑制新生血管生成抑制因子之一，F(xiàn)ibulin-5可促進(jìn)TSP-1的表達(dá)，從而起到抑制新生血管的生成；②Fibulin-5可抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，遷移等功能而發(fā)揮其抑制血管生成的作用。

肛墊是人體的正常結(jié)構(gòu)。肛墊上皮具有豐富的神經(jīng)末梢，具有精確分辨大便性質(zhì)的能力，因此它具有良好的控便作用。一般認(rèn)為痔上黏膜環(huán)切術(shù)(PPH術(shù))是懸吊肛墊，使下移的肛墊恢復(fù)到原來的位置，并沒有切除內(nèi)痔本身[5]。研究者通過對Ⅲ度脫垂性內(nèi)痔患者行痔PPH手術(shù)，收取其標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)含有肛墊的的特征性結(jié)構(gòu)。韓煒等[6]對Ⅲ度脫垂性內(nèi)痔患者行PPH術(shù)后，收?、蠖让摯剐詢?nèi)痔組織進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)痔組織彈性纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并且微血管密度計數(shù)明顯增加，MMP9的表達(dá)也顯著上調(diào)。隨后，王振軍等[7]進(jìn)一步對Ⅲ度脫垂性內(nèi)痔組織通過HE染色發(fā)現(xiàn)，與正常的肛墊組織比較，Ⅲ度脫垂性內(nèi)痔組織中的彈性纖維數(shù)量減少，密度降低，并且竇狀血管表現(xiàn)為管壁結(jié)構(gòu)成分不足，彈性纖維不規(guī)則，血管內(nèi)彈力板結(jié)構(gòu)模糊不清，血管壁上可見大量的新生血管。

肛墊下移學(xué)說認(rèn)為，脫垂性內(nèi)痔是肛墊支持組織、黏膜下血管發(fā)生病理性改變導(dǎo)致肛墊移位的結(jié)果。主要臨床癥狀表現(xiàn)為便血與痔核脫出。肛墊的支持組織是肌性結(jié)構(gòu)，主要作用是固定肛墊，肛墊支持組織的松弛可導(dǎo)致肛墊下移。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“脾主肌肉”，肌肉的豐滿、營養(yǎng)的供給和功能的實現(xiàn)都需要脾胃功能的正常運作。脾胃虛弱，肌肉不充，功能弱化，在肛墊中可表現(xiàn)為肛墊支持組織的疏松；脾胃虛弱，氣虛血液統(tǒng)攝無力，可表現(xiàn)為便血，日久導(dǎo)致氣虛下陷，托舉無力，可導(dǎo)致肛墊下移，表現(xiàn)為痔核脫出。

李東垣根據(jù)“補其中而升其陽”“下者舉之”的原則，首創(chuàng)補中益氣湯。補中益氣湯中黃芪為君藥。味甘入脾經(jīng)，具有補中益氣，升陽固表之功效，恢復(fù)中氣功能，使脾陽得升。臣以人參，大補元氣，元氣可與中氣互相轉(zhuǎn)化，協(xié)調(diào)全身氣機。白術(shù)、甘草補中健脾，恢復(fù)脾的運化，氣血化生有源。氣虛日久，血脈空虛，以當(dāng)歸養(yǎng)血和營。陳皮理氣和胃，濁陰得將，脾胃升降相因。升陽風(fēng)藥升麻、柴胡升舉陽氣，使下陷的臟器恢復(fù)到原來的位置。

本研究在前輩“下者舉之”的理論上，應(yīng)用補中益氣湯聯(lián)合草木犀流浸液片治療Ⅲ度脫垂性內(nèi)痔患者，收集痔PPH術(shù)后收?、蠖让摯剐詢?nèi)痔組織標(biāo)本，運用Western blot法及qPCR檢測檢測其Fibulin-5蛋白及Fibulin-5 mRAN是否表達(dá)。研究結(jié)果顯示：在Ⅲ°脫垂性內(nèi)痔組織標(biāo)本中檢測到了Fibulin-5蛋白及FiBulin-5mRNA的表達(dá)，并且FiBulin-5mRNA在3組中的表達(dá)水平表現(xiàn)為補中益氣湯+草木犀浸液片組＞草木犀流浸液片組＞空白組，F(xiàn)ibulin-5蛋白在3組的表達(dá)情況為補中益氣湯+草木犀浸液片組＞草木犀流浸液片組，補中益氣湯+草木犀浸液片組＞空白組，草木犀流浸液片組與空白組中Fibulin-5蛋白表達(dá)無顯著差異。表明補中益氣湯可促進(jìn)FiBulin-5 mRNA及Fibulin-5蛋白的表達(dá)。說明相對正常肛墊而言，內(nèi)痔組織中Fibulin-5蛋白及Fibulin-5 mRAN的表達(dá)水平下調(diào)。

肛墊組織中Fibulin-5蛋白及Fibulin-5 mRAN的表達(dá)水平下調(diào)可能促進(jìn)肛墊結(jié)締組織中的彈性纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，表現(xiàn)為排列不規(guī)則、斷裂、彈性纖維含量減少、密度減低等現(xiàn)象，而減弱或失去彈性纖維的功能，促進(jìn)肛墊結(jié)締組織的老化；另一方面，肛墊組織中Fibulin-5蛋白及Fibulin-5 mRAN的表達(dá)水平下調(diào)可能使肛墊黏膜下竇狀血管內(nèi)的彈力板彈性纖維變性，表現(xiàn)為彈力板結(jié)構(gòu)模糊；可能導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的調(diào)節(jié)紊亂，竇狀血管壁結(jié)構(gòu)成分受到降解或合成不足，新生血管生成，最終促進(jìn)肛墊下移。因此肛墊組織中Fibulin-5蛋白及Fibulin-5 mRAN的表達(dá)水平下調(diào)可能是脫垂性內(nèi)痔形成的病理學(xué)機制。