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        益氣活血解毒中藥對(duì)梗阻性腎病細(xì)胞自噬的調(diào)控作用

        2018-12-04 10:52:28柴亞男郝娟馬雪蓮閆翠環(huán)王香婷許慶友
        新中醫(yī) 2018年12期
        關(guān)鍵詞:醛固酮梗阻性纈沙坦

        柴亞男 ,郝娟 ,馬雪蓮 ,2,閆翠環(huán) ,王香婷 ,2,許慶友 ,2

        1.河北中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,河北 石家莊 050091 2.河北省肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050091

        梗阻性腎病是指因尿流障礙導(dǎo)致腎臟實(shí)質(zhì)性損害的疾病,腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensin aldosterone system,RAAS)在其發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,尤其是醛固酮,可以激活鹽皮質(zhì)激素受體(Mineralocorticoid receptor,MR),誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、表型轉(zhuǎn)化、凋亡、炎性壞死以及自噬等,進(jìn)而發(fā)展為腎間質(zhì)纖維化。細(xì)胞增殖等已有較多的研究,而細(xì)胞自噬在其中的作用尚需深入觀察。細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞在溶酶體的介導(dǎo)下降解受損的細(xì)胞器和異常大分子蛋白,從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及形態(tài)功能完好的過(guò)程。Kim WY等[1]在單側(cè)輸尿管結(jié)扎(Unilateral ureteral obstruction,UUO)所致梗阻性腎病的早期階段檢測(cè)到了自噬的發(fā)生,并證實(shí)其早于細(xì)胞凋亡和腎小管纖維化。本實(shí)驗(yàn)采用UUO建立梗阻性腎病的大鼠模型,誘導(dǎo)MR活化,給予益氣活血解毒中藥治療,并采用血管緊張素II(Angiotensin II,AngII)受體拮抗劑纈沙坦作為陽(yáng)性對(duì)照,通過(guò)檢測(cè)自噬蛋白及相關(guān)通路的表達(dá),探討益氣活血解毒中藥對(duì)梗阻性腎病中細(xì)胞自噬的影響。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選用清潔級(jí)雄性Wistar大鼠48只,體質(zhì)量(180±20)g,購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(冀)2013-1003,隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(UUO組)、纈沙坦組(Val組)和中藥組(TCM組),每組12只。

        1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 纈沙坦購(gòu)自諾華公司;益氣活血解毒中藥選用廣東一方制藥公司免煎顆粒(黃芪15 g,僵蠶、地龍、蟬蛻、烏蛇、丹參、鱉甲、赤芍、金銀花、野菊花、蒲公英、當(dāng)歸各10 g,大黃6 g),按比例混勻煎煮15 min,水煎液含生藥4 kg/L,參照徐叔云《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》折合大鼠用量為14 g/(kg·d)給藥。

        1.3 試劑和儀器 糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶(Serum and glucocorticoid induced kinase,SGK-1)抗體選用Affbiotech產(chǎn)品,磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase,P-ERK)和 GAPDH抗體選用Bioworld Technology產(chǎn)品,mTOR、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Phosphorylated target of rapamycin,P-mTOR)和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Microtubular-associated protein 1 light chain 3,LC3)抗體選用Cell Signaling Technology產(chǎn)品,自噬相關(guān)基因5(Autophagy associated gene 5,Atg5)和 Beclin-1抗體選用Proteintech產(chǎn)品,免疫組化試劑盒選用北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。電泳儀及電泳槽(北京六一公司),OLYMPUS VANOX PM-10AD型顯微照相儀(OLYMPUS公司),LEICARM 2245型石蠟切片機(jī)(LEICA上海分公司),ODY-3059掃描儀(Li-cor公司)。

        1.4 模型制備及給藥方法 實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,通過(guò)UUO建立梗阻性腎病的動(dòng)物模型,用10%的水合氯醛以3 mL/kg的劑量通過(guò)腹腔注射麻醉動(dòng)物,Sham組于左側(cè)中腹部切開(kāi)皮膚,僅將輸尿管游離但不結(jié)扎不切斷,逐層縫合皮膚;UUO組于左側(cè)中腹部切開(kāi)皮膚,游離左側(cè)輸尿管,分別在輸尿管上1/3及下1/3處用絲線結(jié)扎后切斷輸尿管,逐層縫合皮膚;Val組和TCM組造模同UUO組。各組分別于造模前1天開(kāi)始給藥,造模當(dāng)天不給藥,纈沙坦組給予纈沙坦10 mg/(kg·d)灌胃;中藥組給予中藥煎劑14 g/(kg·d)灌胃;UUO組及Sham組均給予與治療組等量的生理鹽水灌胃。10天后處死動(dòng)物,摘取梗阻側(cè)的腎臟,一部分組織放入4%多聚甲醛中固定,石蠟包埋后切片行免疫組化染色;剩余組織-70℃保存,用于Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)。

        1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法 每組選取4只大鼠檢測(cè)指標(biāo)。采用SABC法檢測(cè)LC3、Beclin-1、Atg5、P-mTOR的表達(dá),一抗?jié)舛染鶠?∶100。Western blot檢測(cè)自噬蛋白、MR的激活及相關(guān)通路的表達(dá)。取冰凍腎臟組織100 mg加裂解液(含蛋白酶抑制劑)0.4 mL,提取蛋白并測(cè)定含量,配制相應(yīng)濃度的濃縮膠和分離膠,加入上樣蛋白適量,電泳后轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉,加入一抗 Atg5、Beclin-1、LC3II/I、SGK-1、P-ERK1/2、P-mTOR抗體(1∶1 000),4℃過(guò)夜,次日TBS清洗3次,加入相應(yīng)二抗(1∶20 000)孵育后TBS清洗3次,顯影,與所得內(nèi)參進(jìn)行校正后比較。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)資料采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,結(jié)果滿足正態(tài)性分布,采用單因素方差分析(One-way ANOVA),數(shù)值變量以(±s)表示,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠腎組織LC3、Beclin-1、Atg5和P-mTOR表達(dá)結(jié)果比較 見(jiàn)圖1。Sham組的LC3、Beclin-1和Atg5呈弱表達(dá),見(jiàn)于腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜,而UUO組表達(dá)明顯增強(qiáng),主要見(jiàn)于腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜;與UUO組比較,Val組和TCM組LC3、Beclin-1和Atg5表達(dá)均明顯減弱。Sham組P-mTOR呈陽(yáng)性表達(dá),見(jiàn)于腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核,UUO組表達(dá)減弱;與UUO組比較,Val組和TCM組P-mTOR表達(dá)增強(qiáng)。

        2.2 各組大鼠腎組織Atg5、Beclin-1和LC3II/I表達(dá)結(jié)果比較見(jiàn)表 1。與 Sham組比較,UUO組大鼠 Atg5、Beclin-1、LC3II/I表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01);與UUO組比較,Val組和TCM組大鼠Atg5、Beclin-1、LC3II/I表達(dá)明顯減弱(P<0.05,P<0.01)。

        2.3 各組大鼠腎組織SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR/mTOR表達(dá)結(jié)果比較 見(jiàn)表2。與Sham組比較,UUO組SGK-1、P-ERK1/2表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01);與UUO組比較,Val組和TCM組SGK-1、P-ERK1/2表達(dá)明顯減弱(P<0.05,P<0.01)。與Sham組比較,UUO組P-mTOR/mTOR表達(dá)減弱(P<0.01),與UUO組比較,Val組和TCM組P-mTOR/mTOR表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)。

        圖1 各組大鼠腎組織LC3、Beclin-1、Atg5和P-mTOR表達(dá)結(jié)果比較 (×400)

        表1 各組大鼠腎組織Atg5、Beclin-1和LC3II/I表達(dá)結(jié)果比較(±s) μg/μL

        表1 各組大鼠腎組織Atg5、Beclin-1和LC3II/I表達(dá)結(jié)果比較(±s) μg/μL

        與Sham組比較,①P<0.01;與UUO組比較,②P<0.05,③P<0.01

        組 別S h a m組U U O組V a l組T C M組n 4 4 4 4 A t g 5 0.1 6 5±0.1 0 2 2.2 7 0±0.8 6 4①0.6 9 5±0.2 7 6③0.8 3 2±0.3 3 3③B e c l i n-1 0.1 9 5±0.0 8 6 0.3 6 5±0.0 4 0①0.2 6 0±0.0 9 0②0.2 7 0±0.0 9 2②L C 3 I I/I 1.3 7 5±0.2 6 2 4.7 8 0±1.1 6 7①3.4 3 8±0.2 5 2②3.6 0 8±0.4 5 8②

        表2 各組大鼠腎組織SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR/mTOR表達(dá)結(jié)果比較(±s) μg/μL

        表2 各組大鼠腎組織SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR/mTOR表達(dá)結(jié)果比較(±s) μg/μL

        與Sham組比較,①P<0.01;與UUO組比較,②P<0.05,③P<0.01

        組 別S h a m組U U O組V a l組T C M組n 4 4 4 4 S G K-1 0.4 8 3±0.5 3 2 1.2 4 0±0.1 9 8①0.8 6 0±0.1 0 5②0.9 9 0±0.1 0 8②P-E R K 1/2 0.4 0 0±0.1 3 7 0.7 9 5±0.9 4 7①0.5 5 3±0.9 2 2③0.5 5 8±0.4 1 9③P-m T O R/m T O R 1.6 1 3±0.2 5 7 0.4 4 5±0.2 5 4①1.4 7 2±0.0 7 9③1.3 7 7±0.2 4 1③

        3 討論

        UUO模型是研究腎間質(zhì)纖維化的常用模型。有研究證實(shí)UUO可以促進(jìn)醛固酮的分泌,醛固酮不僅可以調(diào)節(jié)鈉離子及水分子的再吸收,還參與了炎癥損傷和氧化應(yīng)激等病理反應(yīng)[2],在UUO大鼠的腎臟中,富含線粒體和氧化酶的近端小管更容易受損[3];我們之前通過(guò)檢測(cè)UUO大鼠的血清及尿液中8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OhdG)含量,也證實(shí)了醛固酮很可能通過(guò)氧化應(yīng)激加重腎臟損傷[4]。SGK-1是一種絲氨酸轉(zhuǎn)移酶,參與了醛固酮誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、炎性損傷和腎臟纖維化等病理過(guò)程,是反映醛固酮誘導(dǎo)臟器損傷的重要介質(zhì)[5]。本實(shí)驗(yàn)采用Western blot檢測(cè)SGK-1蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示與Sham組比較,UUO組SGK-1的表達(dá)明顯增強(qiáng),證實(shí)醛固酮通過(guò)SGK-1通路誘導(dǎo)腎臟的損傷。

        氧化應(yīng)激不僅與醛固酮有密切的聯(lián)系,也是影響自噬發(fā)展的重要因素。Chen Y等[6]提出在葡萄糖或血清等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的情況下,活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)最初產(chǎn)物超氧陰離子自由基(O2-)參與了自噬的發(fā)生,當(dāng)細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)時(shí),H2O2分子會(huì)立即激活延伸進(jìn)而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。LC3是自噬的標(biāo)志性蛋白[7],以LC3I和LC3II 2種形式存在于細(xì)胞中,當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)存在于細(xì)胞質(zhì)中的LC3I經(jīng)過(guò)泛素修飾過(guò)程與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合,即轉(zhuǎn)化為分子量較小的LC3II,并聚集形成自噬體膜,所以通常采用Western blot檢測(cè)LC3II/I來(lái)評(píng)價(jià)自噬的活性[8]。Beclin-1是自噬基因Atg6/Vps30的同源基因[9],通過(guò)與III型磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)結(jié)合形成Beclin1-PI3K復(fù)合物,引導(dǎo)相關(guān)蛋白形成蛋白復(fù)合體,促進(jìn)自噬體膜的形成[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot和免疫組化檢測(cè)LC3和Beclin-1的表達(dá)證實(shí)了在UUO所致的梗阻性腎病中自噬的發(fā)生。

        P-ERK1/2通路在營(yíng)養(yǎng)缺乏或氧化損傷的條件下很容易被激活,有研究表明醛固酮與胞漿內(nèi)受體結(jié)合,可快速誘導(dǎo)P-ERK1/2激酶的磷酸化[11],通過(guò)P-ERK1/2磷酸化將信號(hào)從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核,促進(jìn)其與自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。自噬過(guò)程主要受自噬相關(guān)基因(Atg)調(diào)控,其中Atg5在促進(jìn)自噬的發(fā)展和減緩腎臟損傷的過(guò)程中起到了重要作用。在自噬體的延伸階段,有Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合物于其外膜結(jié)合[12],該復(fù)合物的形成對(duì)自噬過(guò)程至關(guān)重要,因?yàn)槠渲腥魏纬煞值耐蛔兌紩?huì)導(dǎo)致自噬缺陷[13];Li HY等[14]用免疫熒光法分別檢測(cè)敲除Atg5小鼠與未敲除Atg5小鼠中LC3II的陽(yáng)性表達(dá)發(fā)現(xiàn),與未敲除Atg5的小鼠相比,敲除Atg5小鼠中的細(xì)胞自噬明顯受到抑制,且腎臟纖維化更嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)中UUO組大鼠LC3、Beclin-1和Atg5的表達(dá)較Sham組明顯增強(qiáng),且與SGK-1、P-ERK1/2的表達(dá)增強(qiáng)相一致,說(shuō)明MR活化后通過(guò)SGK-1通路和P-ERK1/2通路促進(jìn)了梗阻性腎病中自噬的發(fā)生。

        P-ERK1/2下游的P-mTOR通路也是調(diào)控自噬的1條重要通路,P-mTOR是1種存在于哺乳動(dòng)物中的非典型的絲氨酸激酶,是自噬的負(fù)調(diào)控分子。梗阻性腎病早期生物體內(nèi)的調(diào)節(jié)機(jī)制反應(yīng)可以抑制P-mTOR的表達(dá),激活細(xì)胞自噬,從而清除細(xì)胞內(nèi)因輸尿管梗阻產(chǎn)生的異常蛋白分子和過(guò)氧化物等物質(zhì)[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在UUO術(shù)后早期P-mTOR通路被抑制,自噬表達(dá)增強(qiáng),當(dāng)給予纈沙坦和益氣活血解毒中藥治療后P-mTOR表達(dá)增強(qiáng),自噬受到抑制。

        RAAS激活后,AngII在膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯酮環(huán)節(jié)發(fā)揮了重要作用,從而促進(jìn)醛固酮的合成。纈沙坦是AngII受體拮抗劑,可以通過(guò)抑制AngII的作用阻斷醛固酮的合成,所以選用纈沙坦作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

        梗阻性腎病發(fā)病與中醫(yī)學(xué)中的腎著、癃閉等疾病相似,其病因以脾腎虧虛為本,氣血瘀滯,痰濕阻塞尿道為標(biāo),總屬“虛、瘀、毒”范疇。氣虛則衛(wèi)外不固,邪氣侵襲臟腑而發(fā)?。黄⒛I虧虛則氣血津液運(yùn)化失常,痰濁、水濕聚而成“瘀”;氣血運(yùn)行不暢,濁邪壅阻于內(nèi),日久成“毒”,治療當(dāng)“益氣、活血、解毒”。方中黃芪益氣扶正;丹參、赤芍活血散瘀;地龍、烏梢蛇、僵蠶、醋鱉甲通絡(luò)散結(jié);大黃、黃芩、金銀花、蒲公英清熱解毒。前期研究發(fā)現(xiàn),益氣活血解毒中藥可下調(diào)炎性因子表達(dá),減輕炎癥損傷,減緩梗阻性腎病的進(jìn)展[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明給予中藥治療后,UUO大鼠腎臟內(nèi)醛固酮的活性降低,自噬的表達(dá)明顯受到了抑制。

        本實(shí)驗(yàn)觀察益氣活血解毒中藥對(duì)梗阻性腎病中細(xì)胞自噬的影響,結(jié)果顯示UUO組細(xì)胞自噬的表達(dá)與MR的活化程度均明顯高于Sham組,而Val組和TCM組均受到抑制??梢?jiàn)益氣活血解毒中藥可以通過(guò)調(diào)控SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR通路抑制MR的活化,減緩梗阻性腎病中細(xì)胞自噬的發(fā)生,從而減輕腎臟損傷。

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