劉麗華，付熙瑤，王嘉陽，劉美琦，單子笑，欒雪紅

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程，細(xì)胞在周期時相的變遷中進(jìn)入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態(tài)［1］.調(diào)控細(xì)胞周期的蛋白主要包括細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（Cyclindependent kinase，CDK）及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（Cyclin dependent kinase inhibitor，CKI）.其中，Cyclin為正調(diào)控蛋白家族，通過依次激活相應(yīng)的CDK活性，從而推動細(xì)胞周期進(jìn)程［2］.Cyclin廣泛存在于多種生物體內(nèi)［3-4］，在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了20多種，在家蠶體內(nèi)報道了6種，即CyclinA［5］、CyclinB［6］、CyclinB3［6］、CyclinE［7］、CyclinL1［8］、CyclinH［9］.

家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，生殖及發(fā)生與家蠶的經(jīng)濟(jì)性狀密切相關(guān)，研究家蠶生殖與分化對蠶種、蠶絲生產(chǎn)具有重要的理論指導(dǎo)意義［10］.家蠶精巢發(fā)育是一個極其復(fù)雜的生理過程，受到多種因素的調(diào)節(jié)，包括激素、營養(yǎng)、基因調(diào)節(jié)等等，同時在此過程中伴隨著精子的發(fā)生過程，這一過程經(jīng)歷有絲分裂及減數(shù)分裂等，最終發(fā)育為成熟的精子，在此過程中細(xì)胞周期蛋白發(fā)揮重要的調(diào)控作用.為了從分子水平上探索家蠶精巢與精子發(fā)生機(jī)制，本文通過檢測家蠶精巢在5齡幼蟲不同發(fā)育時期細(xì)胞周期蛋白基因（CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE）在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)變化，旨在為揭示細(xì)胞周期蛋白在家蠶生殖細(xì)胞發(fā)生過程中的分子機(jī)制提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用的家蠶品種是由蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院蠶桑實驗室提供的大造，用桑葉在26℃、濕度65%～75%條件下飼養(yǎng).分別取家蠶5齡1～8d幼蟲精巢凍存于液氮中備用.

1.2 方法

（1）精巢組織總RNA提取及cDNA制備.家蠶5齡1～8d幼蟲精巢總RNA提取，按照Trizol-A+試劑盒（TaKaRa公司）說明書進(jìn)行，測定OD值，檢測其濃度和純度.反轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行.

（2）實時熒光定量 PCR.CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因、Actin3內(nèi)參基因的引物設(shè)計及實時熒光定量PCR過程均與本文作者劉麗華［11］等相同.

（3）構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線.用雙蒸水以10倍梯度分別將上述基因稀釋成6個濃度梯度，進(jìn)行Realtime PCR，以所得Ct值（循環(huán)閾值）為縱坐標(biāo)，log值（對應(yīng)的模板拷貝數(shù)常用對數(shù)）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.

（4）數(shù)據(jù)分析.利用ABI 7300儀器自帶的Sequence detection software version 1.3.1軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，并參照 Jan H Schefe［12］的方法進(jìn)行效率校正.

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

家蠶細(xì)胞周期蛋白家族基因的實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示.由圖1可知，擴(kuò)增曲線良好，各曲線相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，符合定量PCR的要求.

2.2 細(xì)胞周期蛋白家族基因在家蠶5齡幼蟲精巢不同發(fā)育時期的表達(dá)

對家蠶5齡幼蟲不同發(fā)育時期精巢的Cyclin家族基因mRNA轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行檢測.結(jié)果如圖2所示，細(xì)胞周期蛋白家族基因在5齡幼蟲期都能檢測到表達(dá).CyclinB相對轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他成員，而CyclinA相對表達(dá)水平較低，并且呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢.其他細(xì)胞周期蛋白家族基因在5齡2d時，轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平均呈下降趨勢，而后逐步上升5d后，則相對表達(dá)水平又降低.

圖1 家蠶細(xì)胞周期蛋白家族基因的實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 家蠶Cyclin家族基因在5齡幼蟲1～8d精巢中的轉(zhuǎn)錄特征

3 討論

在發(fā)育生物學(xué)中，個體形態(tài)建成以及性腺形成是兩個非常重要的過程.很多基因在這些過程中起著重要作用，他們相互作用調(diào)控著整個發(fā)育過程，其中細(xì)胞周期蛋白基因起著非常重要的作用.已有研究表明，細(xì)胞周期蛋白家族基因在5齡中期各組織的轉(zhuǎn)錄水平存在差異，除CyclinE在脂肪體中表達(dá)較高外，其他成員都在精巢中表達(dá)量最高［12］，說明Cyclin家族基因在家蠶精母細(xì)胞形成精子的過程中發(fā)揮著重要作用.

本試驗在轉(zhuǎn)錄水平上對家蠶5齡幼蟲Cyclin家族基因在精巢不同發(fā)育階段的表達(dá)進(jìn)行了檢測.結(jié)果表明，Cyclin家族基因在5齡幼蟲精巢不同發(fā)育階段都能檢測到表達(dá)，但表達(dá)水平相差很大.CyclinA相對表達(dá)水平較低，并呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，這與家蠶在此期的生長發(fā)育特點(diǎn)相關(guān)，家蠶生長到3齡末4齡初時，進(jìn)入成熟期，開始進(jìn)行減數(shù)分裂，第一次減數(shù)分裂周期很長，一直持續(xù)到4齡末或5齡初才進(jìn)入中期、后期而完成分裂.有研究證明，CyclinA1只在哺乳動物雄性生殖細(xì)胞的第一次減數(shù)分裂之前或期間表達(dá)［13］，CyclinA1的關(guān)鍵作用是在生精細(xì)胞的減數(shù)分裂期激活CyclinB，從而使細(xì)胞完成G2/M期的轉(zhuǎn)換過程［14］.這與本試驗的研究結(jié)果相同.CyclinB的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他成員，已有研究表明，哺乳動物B型周期蛋白在睪丸生殖細(xì)胞中表達(dá)水平很高［15］，說明CyclinB基因與精母細(xì)胞的減數(shù)分裂、精細(xì)胞的大量形成有密切關(guān)系.CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因在5齡2d時，轉(zhuǎn)錄水平均呈下降趨勢，而后逐步上升5d后則相對表達(dá)水平下降.表明此期精母細(xì)胞成熟分裂即將完成，進(jìn)入變形期.

精子發(fā)生是一個特殊的雄性生殖細(xì)胞的分化過程，也是一個特殊的細(xì)胞周期運(yùn)行過程，在此過程中，特定的基因嚴(yán)格按照時間、空間順序表達(dá).細(xì)胞周期蛋白與有絲分裂、減數(shù)分裂密切相關(guān)，Debra J等研究證實細(xì)胞周期蛋白基因在精子發(fā)生過程中參與了關(guān)鍵性調(diào)控［16］.因此，對細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)研究將為深入了解生精過程的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ).