溫子祿 王琳 王軍 陳輝 李洪偉 朱益軍 蔣韶寧 張舒林 宋言崢

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染引起的長(zhǎng)期危害人類健康的一種慢性疾病，是全球十大死因之一。WHO[1]估計(jì)，2016年有60萬(wàn)例利福平耐藥新發(fā)患者，其中有49萬(wàn)例為耐多藥結(jié)核病。近年來(lái)，非結(jié)核分枝桿菌(NTM)肺病呈快速增多趨勢(shì)，NTM肺病與結(jié)核病相比無(wú)臨床特異性，誤診率極高。大多數(shù)NTM對(duì)抗結(jié)核藥物天然耐受，嚴(yán)重干擾了結(jié)核病的預(yù)防與治療。由于耐藥MTB的流行，嚴(yán)重影響了結(jié)核病的化療效果。筆者對(duì)在我院胸外科接受手術(shù)治療、臨床資料齊全的結(jié)核病患者進(jìn)行回顧性分析，初步探討術(shù)后標(biāo)本行分子生物學(xué)檢測(cè)對(duì)結(jié)核病患者診療的價(jià)值。

資料和方法

一、 研究對(duì)象

回顧性分析2015年1月至2018年2月期間在上海市公共衛(wèi)生臨床中心胸外科接受手術(shù)治療、并且臨床資料齊全的170例結(jié)核病患者。170例患者中，男100例(58.82%)、女70例(41.18%)； 1～18歲年齡組18例(10.59%)、19～65歲年齡組142例(83.53%)、66～82歲年齡組10例(5.88%)；肺結(jié)核39例(22.94%)、肺外結(jié)核131例(77.06%)。

二、研究方法

取術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，主要包括菌種鑒定和耐藥基因檢測(cè)兩方面，本研究采用的分子檢測(cè)方法為PCR膜條雜交、二代測(cè)序技術(shù)。所有患者均進(jìn)行痰及穿刺活檢或者手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行抗酸染色涂片檢測(cè)。在進(jìn)行上述涂片抗酸染色檢查的同時(shí)，170例患者的標(biāo)本均由檢驗(yàn)科進(jìn)行分枝桿菌改良羅氏固體培養(yǎng)、BACTEC MGIT 960快速液體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“MGIT 960培養(yǎng)”)及藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)，然后采用免疫膠體金法檢測(cè)MGIT 960培養(yǎng)產(chǎn)物中的MPB64抗原(以下簡(jiǎn)稱“MPB64抗原檢測(cè)”)，以檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌。

結(jié) 果

一、抗酸染色涂片檢測(cè)

痰涂片抗酸染色檢測(cè)的陽(yáng)性率為9.41%(16/170)，其中肺結(jié)核患者痰涂片抗酸染色檢測(cè)的陽(yáng)性率為23.08%(9/39)； 而非痰液(包括穿刺活檢、手術(shù)標(biāo)本如膿液或分泌物等)涂片抗酸染色檢測(cè)的陽(yáng)性率為51.76%(88/170)(表1)。

二、 分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)

分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性率為27.65%(47/170)，藥敏試驗(yàn)?zāi)退幗Y(jié)核病的檢出率為14.12%(24/170)(表1)。

表1 各檢測(cè)技術(shù)對(duì)本組170例患者結(jié)核分枝桿菌或藥敏試驗(yàn)檢出陽(yáng)性率的統(tǒng)計(jì)

表2 7例NTM感染患者臨床診斷及標(biāo)本行分子生物學(xué)技術(shù)與涂片抗酸染色檢測(cè)結(jié)果的比較

注“-”表示未做相應(yīng)的檢測(cè)；“N”代表陰性結(jié)果，指培養(yǎng)結(jié)果為陰性，無(wú)法判斷是否耐藥

三、 分子生物學(xué)菌種鑒定

47例分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性的檢測(cè)中42例MPB64抗原檢測(cè)為陽(yáng)性，5例MPB64抗原檢測(cè)為陰性；根據(jù)試劑盒的說(shuō)明，培養(yǎng)陽(yáng)性MPB64陽(yáng)性可以判定為結(jié)核分枝桿菌，而培養(yǎng)陽(yáng)性MPB64陰性可以判定為NTM。術(shù)后對(duì)手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行分子生物學(xué)菌種鑒定的陽(yáng)性率為51.76%(88/170)。陽(yáng)性結(jié)果中7例為NTM，4例培養(yǎng)聯(lián)合MPB64抗原檢測(cè)結(jié)果顯示為NTM，但未進(jìn)行菌種鑒定；3例培養(yǎng)結(jié)果為陰性無(wú)法進(jìn)行MPB64抗原檢測(cè)。7例標(biāo)本分子生物學(xué)菌種鑒定結(jié)果為：1例瘰疬分枝桿菌、戈登分枝桿菌復(fù)合感染，3例胞內(nèi)分枝桿菌， 1例海分枝桿菌， 1例鳥分枝桿菌，1例膿腫分枝桿菌(表1，2)。

四、 分子生物學(xué)耐藥檢測(cè)

除去7例NTM感染患者，剩余的163例患者進(jìn)行了分子生物學(xué)耐藥檢測(cè)；其中，一線抗結(jié)核藥物耐藥(基因)檢出率為54.60%(89/163), 二線抗結(jié)核藥物耐藥(基因)檢出率為49.69%(81/163)。與培養(yǎng)后藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比，培養(yǎng)后藥敏試驗(yàn)陽(yáng)性標(biāo)本中有29.79%(14/47)在分子生物學(xué)耐藥基因檢測(cè)的結(jié)果為陰性，而分子生物學(xué)耐藥檢測(cè)與表型藥敏檢測(cè)結(jié)果一致性為90.00%(27/30)；分子生物學(xué)耐藥基因檢測(cè)與MGIT 960培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)聯(lián)合判斷對(duì)耐藥結(jié)核病的檢出率為63.19%(103/163)。

討 論

WHO[1]2017年全球結(jié)核病相關(guān)報(bào)告估計(jì)，有60萬(wàn)例新發(fā)結(jié)核病患者對(duì)利福平耐藥， 其中49萬(wàn)例患者為耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)。MDR-TB的負(fù)擔(dān)主要落在3個(gè)國(guó)家：印度、中國(guó)和俄羅斯，共占全球MDR-TB患者的近1/2。 2016年，約有6.2%的MDR-TB患者為廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)。在全球范圍內(nèi)，目前只有54%的MDR-TB患者和30%的XDR-TB患者得到了成功治療。2016年5月12日， WHO的新建議旨在通過(guò)使用新型快速診斷試驗(yàn)和更短、更便宜的治療方案，加快檢測(cè)并改善MDR-TB患者的治療效果[1]。

外科技術(shù)用于結(jié)核病的治療已有100余年的歷史。通過(guò)手術(shù)不僅切除了結(jié)核病灶、降低了其對(duì)周圍人群的傳染性，同時(shí)可以對(duì)切除組織標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)，進(jìn)一步找到更有效的藥物，鞏固手術(shù)療效，減少手術(shù)并發(fā)癥。這對(duì)于結(jié)核病的控制和個(gè)體化治療都是非常重要的[2-3]。早在2006年，WHO《耐藥結(jié)核病管理指南》中，已經(jīng)推薦將外科治療作為一種治療MDR-TB患者的重要手段；WHO[4-5]之后的耐藥結(jié)核病管理2008版指南及2016版指南都將外科作為一種積極治療手段，而不是作為輔助治療手段來(lái)治療有手術(shù)指征的MDR-TB患者。

MTB是引起結(jié)核病的單一病原菌，可侵犯全身。在我國(guó)，抗酸涂片鏡檢作為診斷結(jié)核病的初步依據(jù)，但其敏感度和特異度較差，無(wú)法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌。隨著實(shí)驗(yàn)條件的改進(jìn)，目前已研究出了多種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)，主要有四類：(1)生化法。主要依據(jù)是菌株的產(chǎn)色特征和生長(zhǎng)速度等菌落生長(zhǎng)特性，以及菌株不同的生化特征[6]。(2)基因分析法。分子生物學(xué)方法使TB的診斷周期由數(shù)周縮減到幾天，已成為TB快速診斷的輔助手段[7]。(3)免疫學(xué)法。1976年，Nassau等首先將酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 用于血清結(jié)核抗體的檢測(cè)。當(dāng)前應(yīng)用于臨床的結(jié)核病免疫學(xué)診斷包括體液免疫學(xué)診斷(血清學(xué)診斷)和細(xì)胞免疫學(xué)診斷。目前，血清抗體檢測(cè)已成為診斷結(jié)核病常用的輔助手段之一[8-9]。Liu等[10]于2017年報(bào)告了一項(xiàng)將抗體標(biāo)記、能量聚集納米盤與高通量質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合的方法(NanoDisk-MS，納米盤-飛行質(zhì)譜技術(shù))，用以檢測(cè)經(jīng)消化的血清樣本中結(jié)核特異性早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)；該技術(shù)敏感度、特異度高，能夠快速、定量檢測(cè)外周血標(biāo)本，以診斷活動(dòng)性結(jié)核分枝桿菌感染并監(jiān)測(cè)抗結(jié)核藥物治療的效果。(4)菌體特定成分特性分析法：美國(guó)MIDI公司開發(fā)的Sherlock微生物鑒定系統(tǒng)(microbial identification system，MIS) 可分析脂肪酸，通過(guò)單次實(shí)驗(yàn)便能較準(zhǔn)確地鑒定到種[11]。

NTM引起的疾病癥狀與MTB引起的疾病癥狀類似，但是對(duì)經(jīng)典的抗結(jié)核藥物治療無(wú)效，容易導(dǎo)致誤診和不適當(dāng)?shù)闹委?，現(xiàn)已經(jīng)廣泛引起臨床醫(yī)生的重視[12]。MTB與NTM的早期驗(yàn)證和NTM菌種的鑒定對(duì)于痰涂片陽(yáng)性患者的正確治療至關(guān)重要。全球2008年從肺部樣本中分離的不同NTM的菌種有：鳥分枝桿菌復(fù)合群、堪薩斯分枝桿菌、蟾分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、 偶發(fā)分枝桿菌[13]。中國(guó)不同地區(qū)的NTM感染情況不同，一項(xiàng)橫斷面研究入選了2012年1月至2014年12月期間，在兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)核病研究中心(廣州市胸科醫(yī)院和上海市肺科醫(yī)院)分別收集了938和512例NTM樣本，包括門診和病房[14]。

NTM感染呈上升趨勢(shì)，2000—2012年間，在我國(guó)臺(tái)灣大學(xué)醫(yī)學(xué)院分枝桿菌研究室數(shù)據(jù)庫(kù)登記，并通過(guò)培養(yǎng)確定MTB或NTM陽(yáng)性者，其中包括報(bào)告了肺結(jié)核、NTM肺部感染和NTM定植的年發(fā)病率[15]。北美NTM感染與年齡有關(guān)且呈上升趨勢(shì)，一篇綜述檢索了2009—2014年間發(fā)表的關(guān)于北美人群感染NTM的論文，總結(jié)認(rèn)為： NTM患病與年齡有關(guān)，老年患者更易感染NTM；NTM患病率呈上升趨勢(shì)，且與環(huán)境因素有關(guān)，特別是與水、土壤的暴露有關(guān)；NTM病死亡率高，1999—2010年間美國(guó)NTM病的死亡率為0.1/10萬(wàn)；55歲以上老年患者，特別是女性患者具有更高的死亡率[16]。

NTM病主要損害肺部，具有與結(jié)核病臨床表現(xiàn)相似的全身中毒癥狀和局部損害表現(xiàn)，在無(wú)菌種鑒定結(jié)果的情況下，可能誤診為結(jié)核病；多數(shù)NTM對(duì)抗結(jié)核藥物耐藥，用抗結(jié)核藥物治療效果不佳，并且藥物會(huì)對(duì)患者的肝臟及中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷。由于NTM病與結(jié)核病治療上的差異，確定NTM病在臨床上有著重要意義[12]。

細(xì)菌耐藥包括多種機(jī)制，大致可分為五類：(1)減少藥物的吸收；(2)增加外排泵的表達(dá)；(3)酶的失活；(4)抗生素靶標(biāo)的修飾；(5)降低催化前導(dǎo)藥物活化酶的活性。MTB具有特異性、高度疏水性的細(xì)胞壁，組成了天然的滲透屏障，阻礙很多藥物的通透，與藥物相關(guān)的基因突變是MTB對(duì)多數(shù)抗結(jié)核藥物獲得性耐藥的主要耐藥機(jī)制[17-18]。

隨著耐藥MTB的逐漸增多，MTB耐藥性檢測(cè)成為防控結(jié)核病的關(guān)鍵問(wèn)題。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室藥敏試驗(yàn)仍以絕對(duì)濃度法和比例法等常規(guī)方法為主，具有生長(zhǎng)依賴性，即以細(xì)菌生長(zhǎng)為終點(diǎn)判斷結(jié)果。由于MTB生長(zhǎng)緩慢，需1～2個(gè)月方能獲得培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)結(jié)果，遠(yuǎn)不能滿足臨床及時(shí)治療的需要。所以，研發(fā)快速敏感的新型藥敏試驗(yàn)方法則顯得尤為重要。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行MTB耐藥性檢測(cè)已成為現(xiàn)代耐藥性檢測(cè)的必然趨勢(shì)，如線性探針反向雜交法(line probe assay，LiPA)、基因芯片檢測(cè)技術(shù)和二代測(cè)序技術(shù)等；WHO最新推薦使用的Xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)，從標(biāo)本處理到結(jié)果檢測(cè)僅需幾個(gè)小時(shí)，敏感度為96.7%，特異度達(dá)98.6%，是未來(lái)耐藥性檢測(cè)的發(fā)展方向[19-21]。

結(jié)核病尤其是菌陰肺結(jié)核的早期診斷，是對(duì)臨床結(jié)核病防治工作一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)?？刂平Y(jié)核病傳播的關(guān)鍵是盡早發(fā)現(xiàn)、隔離、治療活動(dòng)性結(jié)核病患者。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)在結(jié)核病術(shù)后快速診斷中具有重要的價(jià)值，可區(qū)分結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌及是否耐藥，為結(jié)核病術(shù)后正確用藥提供重要的參考。