林淑芳 魏淑貞 趙永 林建 林勇明

吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)是一線抗結(jié)核藥物化療方案的柱石，在酸性環(huán)境下對(duì)半休眠結(jié)核分枝桿菌(MTB)和持留MTB具有獨(dú)特的滅菌作用，與異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RFP)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)聯(lián)合用于敏感結(jié)核病化療可將療程縮短為6個(gè)月。PZA除了具有與眾不同的藥理作用之外，還與貝達(dá)喹啉和PA-824 等2個(gè)新藥具有協(xié)同抗結(jié)核作用[1-3]，因而PZA也作為非常重要的藥物用于治療耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)。盡管PZA對(duì)治療結(jié)核病至關(guān)重要，但是因?yàn)镻ZA對(duì)體外藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)條件要求比較高，限制了其耐藥性檢測(cè)的普遍開(kāi)展，而且沒(méi)有像INH、RFP和EMB一樣納入到常規(guī)耐藥監(jiān)測(cè)當(dāng)中，所以全球?qū)ZA的耐藥性研究相對(duì)比較少[4]。因此，了解MDR-TB對(duì)PZA的耐藥現(xiàn)狀對(duì)于指導(dǎo)臨床合理用藥非常有意義。

結(jié)核病分子流行病學(xué)研究顯示，全球結(jié)核病流行主要由北京家族、T家族、H家族、CAS家族、LAM家族等菌株群引起，目前多個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)道北京基因型是主要優(yōu)勢(shì)基因型[5-6]。北京基因型導(dǎo)致多個(gè)國(guó)家MDR-TB的暴發(fā)。間隔區(qū)寡核苷酸分型技術(shù)(Spoligotyping)是鑒定北京基因型的金標(biāo)準(zhǔn)，具有可靠、高效和數(shù)字化等特點(diǎn)而被廣大實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用[7-8]。國(guó)內(nèi)外對(duì)MDR-MTB北京基因型菌株與對(duì)PZA耐藥性的關(guān)系研究不多，因此，筆者應(yīng)用Spoligotyping技術(shù)鑒定福建省MDR-MTB的基因型，了解基因型分布情況和北京基因型流行情況，同時(shí)分析對(duì)PZA的耐藥水平及與不同基因型菌株間的關(guān)系。

材料和方法

一、菌株來(lái)源

收集2007—2008年福建省耐藥監(jiān)測(cè)點(diǎn)40株MDR-MTB臨床分離株，以及2010—2011年第五輪全球基金結(jié)核病項(xiàng)目福建省耐藥監(jiān)測(cè)點(diǎn)79株MDR-MTB臨床分離株，共計(jì)119株。MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

二、藥敏試驗(yàn)

采用Guidelinesforsurveillanceofdrugresis-tanceintuberculosis[9]推薦的比例法對(duì)INH、鏈霉素(Sm)、RFP、EMB等4種抗結(jié)核藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。采用WHO[10]推薦的BACTEC MGIT 960系統(tǒng)法(簡(jiǎn)稱“MGIT 960”)檢測(cè)MDR-MTB 對(duì)PZA的耐藥性，濃度為100 μg/ml。

三、細(xì)菌DNA制備

從羅氏(L-J)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的MTB取一菌環(huán)，溶于200 μl的TE緩沖液(pH 8.3)中，在旋渦振蕩器中振蕩均勻后，放在95 ℃水浴鍋中15 min后，以10 000×g離心5 min，取上清。

四、間隔區(qū)寡核苷酸基因分型

(1)直接重復(fù)(DR)間隔區(qū)特異性核苷酸探針序列共43條，見(jiàn)文獻(xiàn)[11]。DR間隔區(qū)擴(kuò)增引物序列：DRa：5′-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3′； DRb：5′-CCGAGAGGGGACGGAAC-3′。其中，DRa的5′端用生物素標(biāo)記，用于雜交后發(fā)光檢測(cè)。(2)43條探針按順序用Miniblotter標(biāo)記在Biodync C膜上(美國(guó)Pall 公司)。(3)DR間隔區(qū)PCR擴(kuò)增體系為50 μl，PCR預(yù)混液25 μl，DRa和DRb各2 μl，DNA模板5 μl，去離子水16 μl。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。同時(shí)擴(kuò)增H37Rv和BCG作為陽(yáng)性對(duì)照。(4)用Miniblotter與探針垂直方向加入DR間隔區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、H37Rv和BCG，空白對(duì)照。雜交爐內(nèi)50 ℃雜交1 h。(5)雜交膜處理后，加入鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物(CDP-Star，購(gòu)自美國(guó)GE公司)孵育，42 ℃孵育30 min，在暗室內(nèi)曝光、顯影。(6)雜交結(jié)果陽(yáng)性用“1”，陰性用“0”表示，錄入到Excel表以二進(jìn)制和八進(jìn)制格式描述每株菌的分型結(jié)果。Spoligotyping結(jié)果提交至SpolDB 4.0(http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVITDemo)[12]和國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)MIRU-VNTR plus(http://www.miru-vntrplus.org)[13]。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用BioNumerics 5.0進(jìn)行分析，采用UPGMA系數(shù)進(jìn)行聚類分析。應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，菌株基因型與其耐藥性之間的差異性分析采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PZA耐藥情況

119株MDR-MTB菌株應(yīng)用MGIT 960進(jìn)行PZA藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示44株對(duì)PZA耐藥，耐藥率為36.97%(44/119)。耐PZA菌株對(duì)Sm的耐藥率為70.45%(31/44)，高于對(duì)PZA敏感菌株對(duì)Sm的耐藥率[50.67%(38/75)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.45，P=0.035)；耐PZA菌株對(duì)EMB的耐藥率為81.82%(36/44)，高于對(duì)PZA敏感菌株對(duì)EMB的耐藥率[52.00%(39/75)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.58，P=0.001)。

二、MDR-MTB菌株的基因型構(gòu)成

119株MDR-MTB菌株經(jīng)Spoligotyping進(jìn)行基因分型，結(jié)果顯示分為2個(gè)基因群，即北京基因型和非北京基因型；共鑒定出9個(gè)基因型(即北京基因型和8個(gè)非北京基因型)；另有8株菌株的基因型在SpolDB 4.0數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索不到相同序列，判為新發(fā)現(xiàn)的基因型，經(jīng)聚類分析，均為非北京基因型的獨(dú)特類型。其中，北京基因型菌株80株，占67.23%；非北京基因型39株(32.77%)，呈現(xiàn)出16個(gè)基因型(含8個(gè)新發(fā)現(xiàn)的基因型)，具體包括H家族(含4株H和10株H3)14株(11.76%，14/119)、T家族(含8株T1、1株T2、4株T3和1株T5)14株(11.76%，14/119)、新發(fā)現(xiàn)的基因型8株(6.72%，8/119)、U基因型2株(1.68%，2/119)、Manu2基因型1株(0.84%，1/119)。非北京基因型以H3(25.64%，10/39)和T1(20.51%，8/39)比較常見(jiàn)。聚類結(jié)果顯示，19株為獨(dú)特類型，其余100株分為7簇，成簇率為84.03%(100/119)，每簇含2株及以上，其中最大的一簇包含75株，菌株全部為ST1，即僅與SP35～SP43之間9個(gè)間隔區(qū)有陽(yáng)性雜交信號(hào)，被稱為典型北京基因型。

三、北京基因型與耐藥的關(guān)系

80株北京基因型菌株有31株對(duì)PZA耐藥(38.75%)，49株對(duì)PZA敏感(61.25%)；39株非北京基因型菌株有13株對(duì)PZA耐藥(33.33%)，26株對(duì)PZA敏感(66.67%)。北京基因型菌株對(duì)PZA的耐藥率與非北京基因型菌株對(duì)PZA的耐藥率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；北京基因型與非北京基因型菌株對(duì)Sm、EMB耐藥率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

討 論

MDR-TB化療方案的一線和二線藥物中PZA發(fā)揮獨(dú)特的作用，全面了解MDR-MTB菌株對(duì)PZA的耐藥水平，對(duì)MDR-TB患者進(jìn)行合理治療具有非常重要的意義。由于PZA僅在酸性(pH 5.0左右)環(huán)境下才能發(fā)揮抗MTB的作用，而低pH值又抑制MTB的生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如pH值輕微變動(dòng)或接種量改變將引起最低抑菌濃度(MIC)的大幅度變化從而使得傳統(tǒng)培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上的PZA藥敏試驗(yàn)結(jié)果可靠性比較差。為了更好指導(dǎo)臨床用藥，WHO推薦[10]應(yīng)用由美國(guó)BD公司研制生產(chǎn)的MGIT 960對(duì)PZA進(jìn)行液體藥敏試驗(yàn)檢測(cè)。該方法在美國(guó)、日本和歐洲等發(fā)達(dá)地區(qū)作為PZA藥敏試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法。筆者應(yīng)用此法對(duì)福建省MDR-MTB菌株進(jìn)行PZA耐藥性檢測(cè)，對(duì)PZA的耐藥率為36.97%，與上海的38.5%[14]和美國(guó)的38%[15]不相上下，低于北京市的57.7%[16]和重慶市的62.4%[17]。此結(jié)果提示，福建省MDR-TB患者應(yīng)用PZA進(jìn)行化療時(shí)，應(yīng)考慮患者可能存在對(duì)PZA耐藥的問(wèn)題。本次研究結(jié)果顯示，對(duì)Sm和EMB耐藥的MDR-MTB菌株對(duì)PZA的耐藥率均明顯高于對(duì)Sm、EMB敏感的菌株，表明MDR-MTB菌株對(duì)PZA耐藥與對(duì)Sm、EMB耐藥具有一定相關(guān)性。重慶市報(bào)道了MTB對(duì)PZA耐藥與對(duì)Sm耐藥具有一定相關(guān)性，而與對(duì)EMB耐藥無(wú)關(guān)[17]。也有文獻(xiàn)報(bào)道MTB對(duì) PZA耐藥與對(duì)RFP耐藥和氧氟沙星(Oflx)耐藥具有相關(guān)性，也就是對(duì)RFP、Oflx耐藥的菌株對(duì)PZA的耐藥率也較高[18]。這可能是患者未經(jīng)藥敏試驗(yàn)就聯(lián)合多種藥物治療所導(dǎo)致的[19]。先前福建省對(duì)涂陽(yáng)肺結(jié)核患者對(duì)PZA耐藥的研究顯示，MDR-TB患者對(duì)PZA的耐藥率明顯高于非MDR-TB患者[20]。可見(jiàn)，臨床上為了確保MDR-TB患者使用合理的化療方案，先行對(duì)PZA進(jìn)行耐藥性檢測(cè)顯得尤為重要。

表1 福建省耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株耐藥情況與基因型分布的關(guān)系

北京基因型MTB分布廣泛而備受全球關(guān)注，主要流行于東亞地區(qū)、中國(guó)、韓國(guó)和日本[21-22]。筆者采用Spoligotyping對(duì)MDR-MTB菌株進(jìn)行分型，結(jié)果顯示北京基因型占67.23%，高于廣西壯族自治區(qū)的55.3%[23]，低于浙江省的70%[24]和河北省的90.5%[25]。進(jìn)一步體現(xiàn)了北京基因型分布具有地域性，說(shuō)明了北京基因型是福建省的主要流行基因型。該基因型菌株流行速度快，傳播范圍廣，因此，今后工作中應(yīng)加強(qiáng)對(duì)北京基因型菌株的監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其傳播規(guī)律，并對(duì)其生物學(xué)特征進(jìn)行深入研究。

本次研究結(jié)果顯示，MDR-MTB菌株非北京基因型占32.77%，呈現(xiàn)為高度的基因多態(tài)性，共16種基因型，以H家族和T家族多見(jiàn)。其中，H3和T1比較常見(jiàn)。據(jù)報(bào)道，H家族和T家族主要流行于非洲、歐洲和中、南美洲地區(qū)[12]。本次研究中H家族和T家族常見(jiàn)可能與福建省位于東南沿海，與全球各地經(jīng)濟(jì)貿(mào)易往來(lái)比較頻繁及日益發(fā)達(dá)的旅游業(yè)引起人口流動(dòng)性較大有關(guān)，再者也可能與福建省的氣候常年炎熱和潮濕有關(guān)。此結(jié)果提示，福建省結(jié)核病防治應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)流動(dòng)性人口結(jié)核病的管理和監(jiān)測(cè)。盡管H家族和T家族也流行于全球其他地區(qū)，但是這兩個(gè)家族具有很高的遺傳異質(zhì)性，不像北京基因型家族基因高度保守，而且Spoligotyping指紋圖譜特征不明確。進(jìn)一步表明了今后應(yīng)該探索其適宜的遺傳標(biāo)志物來(lái)加強(qiáng)對(duì)這2個(gè)家族的監(jiān)測(cè)，為全省結(jié)核病防治策略制定提供參考依據(jù)。

盡管文獻(xiàn)報(bào)道北京基因型多次引起MDR-TB的暴發(fā)，但是關(guān)于北京基因型與耐藥性之間的關(guān)系，我國(guó)各地研究結(jié)果不盡相同。有報(bào)道北京基因型與耐藥性無(wú)關(guān)[23-24]，也有報(bào)道北京基因型與RFP耐藥、MDR和Oflx耐藥有關(guān)[26-27]。本研究顯示，北京基因型與非北京基因型對(duì)PZA耐藥率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，北京基因型與PZA耐藥性無(wú)關(guān)未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。目前報(bào)道北京基因型與耐藥性的關(guān)系研究基本上就只是常規(guī)納入耐藥監(jiān)測(cè)的6種藥物RFP、INH、Sm、EMB、Oflx和卡那霉素進(jìn)行分析[26-27]。因此，北京基因型菌株與耐藥表型之間的關(guān)系及其生物學(xué)特征還有待進(jìn)一步研究。

本研究也存在一定的缺陷，即采用菌株來(lái)源于2007—2008年和2010—2011年福建省耐藥監(jiān)測(cè)點(diǎn)，距今時(shí)限較久。但是當(dāng)時(shí)的監(jiān)測(cè)點(diǎn)多，覆蓋面廣，因此，收集到的菌株具有較好的代表性。

志謝中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病控制所萬(wàn)康林研究員、劉海燦博士對(duì)本研究進(jìn)行了悉心指導(dǎo)和幫助。