黃秀梅，蓋文燕，曲志娜，趙思俊，李月華，王玉東，王君瑋，王 娟

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

沙門氏菌作為一種重要的人獸共患病條件性致病菌，可感染人和動(dòng)物，引起多種疾病，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[1]。沙門氏菌感染人后，最常表現(xiàn)為胃腸炎，易引起惡心、嘔吐、腹痛等癥狀，過量時(shí)可造成食物中毒，危及人的生命安全[2]。動(dòng)物產(chǎn)品中的沙門氏菌污染是導(dǎo)致人類食物中毒的重要因素。沙門氏菌的致病機(jī)制多樣，致病性強(qiáng)弱與其毒力因子表達(dá)密切相關(guān)[3]。沙門氏菌一直以來都是食源性疾病監(jiān)測(cè)中的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，而細(xì)菌耐藥菌株也成為國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)越來越關(guān)注的內(nèi)容。了解并掌握市售豬肉中沙門氏菌耐藥基因、毒力基因攜帶狀況，并利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）對(duì)沙門氏菌進(jìn)行分子分型研究，是降低豬肉產(chǎn)品中沙門氏菌污染的重要途徑，其在沙門氏菌流行病調(diào)查和溯源工作中發(fā)揮著重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2017年從山東省青島市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)市售豬肉中分離的22株沙門氏菌菌株；耐藥性質(zhì)控菌株（ATCC25922），PFGE分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)菌株（沙門氏菌Braenderup H9812），為中國(guó)疾病控制中心傳染病所PulseNet實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱（SLI-700，日本東京理化），水浴搖床（TS-211，上海天呈科技），渦旋振蕩器（WH-2，上海滬西分析儀器廠），可見分光光度計(jì)（722N，上海精密科學(xué)儀器有限公司），PCR儀（TC-S/96，杭州博日科技），CHEF-mapper型脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀、GEL DOCXR凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），VITEK濁度儀（法國(guó)BioMerieux公司）。

1.1.3 主要試劑 SeaKem Gold瓊脂糖（美國(guó)BD公司），腦心浸液培養(yǎng)基、細(xì)菌瓊脂粉（北京陸橋技術(shù)有限公司），耐藥性檢測(cè)板（上海星佰生物技術(shù)有限公司），限制性內(nèi)切酶Xba I（大連TaKaRa公司），引物合成以及蛋白酶K、其他分析純?cè)噭ㄉ虾Ｉど锕煞萦邢薰荆?/p>

1.2 方法

1.2.1 耐藥性測(cè)定 按照國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法（MIC法），測(cè)定分離菌株最小抑菌濃度；參 照 CLSI文 件 VET01-S2（2013） 和 M100-S24（2014）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.2 耐藥基因檢測(cè) 根據(jù)GenBank中的基因序列，并參照文獻(xiàn)[4-7]，設(shè)計(jì)沙門氏菌6類藥物10對(duì)耐藥基因擴(kuò)增引物：β-內(nèi)酰胺類藥物blatem-1、blacmy-2基因，四環(huán)素類藥物tetA基因，氨基糖苷類藥物aadA1、aadA2基因，氟喹諾酮類藥物qnr 基因，磺胺類藥物sulⅠ、sulⅡ、sul Ⅲ基因，氯霉素類藥物CmlA基因。上海生工生物工程有限公司合成耐藥基因引物（表1）。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，Tm退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.2 %瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀上觀察、拍照保存結(jié)果。

表1 10對(duì)耐藥基因引物序列

1.2.3 毒力基因檢測(cè) 按照文獻(xiàn)[8-11]發(fā)表的沙門 氏 菌 mogA、sseL、mgtC、bcfA、araB、spvA、spvB、spvC、spvD、spvR、hisJ、fliC、stn、fimA毒力基因序列，設(shè)計(jì)合成14對(duì)沙門氏菌毒力基因擴(kuò)增引物（表2）。PCR反應(yīng)體系為25 μL： Go Taq? Green Master12.5 μL，模板 DNA 2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，去離子水9.5 μL。5種毒力島核心蛋白基因mogA、sseL、mgtC、bcfA、araB的反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，Tm退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存；5種毒力質(zhì)?；騭pvA、spvB、spvC、spvD、spvR的反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，Tm退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存；其余4種毒力因子基因hisJ、fliC、stn、fimA的反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，Tm退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。每個(gè)樣品取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，用DL2000 DNA Marker 作為參照，140 V恒壓電泳30 min；電泳結(jié)束后用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析，記錄結(jié)果。

表2 毒力基因引物序列

1.2.4 PFGE分型 根據(jù)PulseNet China技術(shù)手冊(cè)中PFGE操作規(guī)范，采用Xba I限制性內(nèi)切酶對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行酶切；將試驗(yàn)獲取的電泳圖譜，用BioNumerics v4.0數(shù)據(jù)庫軟件進(jìn)行處理，識(shí)別圖形條帶。對(duì)聚類圖和矩陣圖，使用非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法（UPGMA）構(gòu)建，條帶位置差異容許度選擇1.0%，優(yōu)化值為0.5%，用Band based/Dice系數(shù)來衡量PFGE帶型之間的相似度，范圍在0～1之間（0表示完全不相關(guān)，1表示完全相同）。在限制性內(nèi)切酶的作用下，不同菌株會(huì)呈現(xiàn)不同條帶數(shù)和不同大小片段，按照PulseNet的命名原則，對(duì)每種不同的帶型進(jìn)行命名。

2 結(jié)果

2.1 菌株耐藥性和耐藥基因攜帶情況

2.1.1 分離菌株耐藥情況 通過測(cè)定分離菌株對(duì)7類12種抗菌藥物的最小抑菌濃度，發(fā)現(xiàn)分離菌株對(duì)氨芐西林耐藥最嚴(yán)重，耐藥率為72.73%；其次是對(duì)氟苯尼考，耐藥率為68.18%。其中，對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物中的氨芐西林、奧格門丁耐藥率相差較大，耐藥率分別為72.73%、36.36%，對(duì)其余同類藥物的耐藥率相差不大（表3）。對(duì)22株沙門氏菌進(jìn)行10種耐藥基因檢測(cè)，共測(cè)出9種耐藥基因。其中：攜帶β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（blatem-1）的菌株最多，占72.73%（16/22）；其次是攜帶四環(huán)素耐藥基因（tetA）的菌株，占36.36%（8/22），攜帶氨基糖苷類耐藥基因（aadA2/ aadA1）菌株分別占31.82%（7/22）和22.73%（5/22）；攜帶磺胺類耐藥基因（sulⅡ/ sulⅠ/ sulⅢ）的菌株較少，分別占27.27%（6/22）、13.64%（3/22）和13.64%（3/22）。檢測(cè)到的耐藥基因與耐藥表型符合率達(dá)95%（圖1和圖2）。

表3 22株分離沙門氏菌對(duì)12種藥物的耐藥性結(jié)果

圖1 耐藥基因電泳結(jié)果

圖2 22株豬源沙門氏菌攜帶耐藥基因結(jié)果

2.2 試驗(yàn)菌株毒力基因攜帶情況

對(duì)22株沙門氏菌進(jìn)行14種毒力基因檢測(cè)，結(jié)果共檢出13種毒力因子。所有分離菌株均攜帶mgtC、bcfA毒力基因，而mogA、araB、stn、fimA基因攜帶率均為95.45%，sseL基因攜帶率為68.18%，hisJ基因攜帶率為45.45%。來自不同地區(qū)的同種血清型沙門氏菌所攜帶的毒力基因有所不同，某些來自同一地區(qū)不同血清型沙門氏菌攜帶的毒力基因基本相同（圖3和圖4）。

2.3 PFGE分型結(jié)果

對(duì)22株沙門氏菌通過沙門氏菌血清型試劑盒進(jìn)行血清型鑒定，共檢測(cè)出12種血清型，其中腸炎沙門氏菌和印第安納沙門氏菌為優(yōu)勢(shì)血清型。

22株沙門氏菌脈沖場(chǎng)電泳結(jié)果顯示（圖5）：22株沙門氏菌共分為8個(gè)群，包括8個(gè)不同的帶型，菌株相似度為60%～100%。PFGE指紋圖譜與血清型具有一定的相關(guān)性，相同血清型的菌株聚類后，都能分到同一群。本研究獲得的7株鼠傷寒沙門氏菌有3個(gè)帶型，依次為01、02、08；6株德爾卑沙門氏菌有4個(gè)帶型，依次為01、04、05、08；4株腸炎沙門氏菌有3個(gè)帶型，依次為03、06、08。

圖3 22株豬源沙門氏菌毒力基因電泳結(jié)果

圖4 22株豬源沙門氏菌攜帶毒力基因結(jié)果

從檢測(cè)結(jié)果看，來自不同區(qū)域的德爾卑沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、湯普遜沙門氏菌攜帶的毒力基因基本一致，而其他血清型的分離菌株所攜帶的毒力基因差別較大；來自4個(gè)不同區(qū)域的腸炎沙門氏菌攜帶的毒力基因情況分為兩種。

3 討論

3.1 耐藥性和耐藥基因

圖5 22株沙門氏菌PFGE分型結(jié)果

分離菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率為36.36%～72.73%，對(duì)四環(huán)素耐藥率為40.91%，對(duì)氨基糖甙類藥物的耐藥率為22.73%～36.36%，對(duì)磺胺類藥物的耐藥率為27.27%～31.82%。16株沙門氏菌均檢測(cè)出blatem-1基因，檢出率為72.73%，遠(yuǎn)高于劉芳萍等[12]從雞源中的檢出率（31.00%），這提示應(yīng)該注意β-內(nèi)酰胺類藥物的合理用藥，防止耐藥性增強(qiáng)及多重耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，進(jìn)而影響人們身體健康。

四環(huán)素類藥物的tetA耐藥基因檢出率為36.36%，稍低于劉芳萍等[12]和Yang等[13]的報(bào)道；對(duì)于氨基糖苷類藥物的aadA1和aadA2基因，檢出率分別為22.73%和31.82%，低于Ahmed等[14]的檢出率；對(duì)于磺胺類藥物的3種耐藥基因sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ均有檢出，且檢出率為13.64%～27.27%。而鄒明等[4]發(fā)現(xiàn) sulⅠ的檢出率較低，而sulⅡ、sulⅢ的檢出率較高，說明可能存在某些措施可以降低沙門氏菌污染。

3.2 毒力基因

對(duì)22株試驗(yàn)菌株進(jìn)行沙門氏菌14對(duì)毒力基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)除毒力質(zhì)粒基因spvB未被檢出外，其余毒力基因均有檢出。其中，毒力島SPI3和SPI4的核心蛋白mgtC、bcfA基因檢出率均為100%；腸毒素stn基因及毒力島SPI1、SPI5核心蛋白基因mogA、araB檢出率均為95.45%。該檢出率與雞蛋中沙門氏菌這5種毒力基因的檢出率大致相同[15]，同時(shí)也有研究表明，雞源沙門氏菌中這5種毒力基因幾乎100%檢出，這表明豬源與雞源沙門氏菌可能都具有較強(qiáng)的毒力，需進(jìn)一步研究其致病性是否一致，深入了解其作用機(jī)制。

本研究中所鑒定出的德爾卑沙門氏菌均攜帶stn、fimA、mogA、mgtC以及bcfA基因；所有攜帶毒力質(zhì)?；蛏抽T氏菌分離株血清型均為腸炎沙門氏菌，且腸炎沙門氏菌均檢測(cè)到5種毒力島基因；鼠傷寒沙門氏菌中80%均攜帶hisJ基因，需大量試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)鼠傷寒沙門氏菌與hisJ毒力基因是否具有一定的聯(lián)系。湯普遜沙門氏菌血清型均檢測(cè)出stn、fimA基因以及5種毒力島基因，另外未檢測(cè)到毒力質(zhì)?；?，也未檢測(cè)到hisJ以及fliC基因，同時(shí)同試驗(yàn)者在關(guān)于雞源沙門氏菌毒力基因的檢測(cè)研究中，也未檢測(cè)到這兩種毒力基因，因而需進(jìn)一步研究其攜帶狀況與沙門氏菌血清型的關(guān)系。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其他血清型沙門氏菌菌株毒力基因檢出情況沒有一定的規(guī)律性，需進(jìn)一步深入研究。

3.3 PFGE分型

本試驗(yàn)對(duì)青島市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)市售豬肉中分離的沙門氏菌進(jìn)行PFGE分子分型，發(fā)現(xiàn)相同血清型菌株基本可以分到同一群，這與先前的報(bào)道[16]一致。同一血清型，根據(jù)不同的遺傳背景，可以分成不同的帶型，說明該方法可以在沙門氏菌表型分型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析其差別，從而在沙門氏菌食源性疾病的暴發(fā)調(diào)查及監(jiān)測(cè)中發(fā)揮作用。此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)血清型較明顯，這可能與樣品的來源有關(guān)。

條帶間相似度差異較小，都在80%左右，且部分菌株條帶差異基本為2～3條。按照Tenover等[17]的觀點(diǎn)，菌株間存在2～3條差異（高度相關(guān)），可能是由酶切位點(diǎn)的點(diǎn)突變、缺失或者插入引起的。但是Barrett等[18]對(duì)于2～3條帶差異的解釋，一種可能是由于沙門氏菌基因組中質(zhì)粒的穩(wěn)定性導(dǎo)致的，另一種情況認(rèn)為由點(diǎn)突變或插入導(dǎo)致的條帶太小，跑出了膠外。所以，對(duì)于條帶相同或高度相似的菌株還應(yīng)該結(jié)合流行病學(xué)資料進(jìn)行分析。

4 結(jié)論

本研究對(duì)青島市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)市售豬肉中分離的沙門氏菌耐藥性及攜帶的耐藥基因、毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行分子分型，發(fā)現(xiàn)市售豬肉中的沙門氏菌以腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌兩種血清型居多，占分離菌株的50%，這兩種血清型對(duì)公共衛(wèi)生具有潛在威脅；分離菌株對(duì)氨芐西林和氟苯尼考的耐藥率分別高達(dá)72.73%和68.18%，并攜帶多種耐藥基因和毒力基因。這對(duì)消費(fèi)者健康構(gòu)成了威脅，須對(duì)豬肉產(chǎn)品生產(chǎn)、加工及銷售過程中的環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格控制，防止環(huán)境中的沙門氏菌對(duì)豬肉產(chǎn)品污染以及產(chǎn)品中的沙門氏菌交叉污染。