劉 洋，胡輝燦，姚 清，趙 墩，余興龍

（湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙 410128）

2017年9月，湖南省郴州市某存欄1 000余頭母豬的豬場突然出現(xiàn)懷孕母豬流產(chǎn)、死亡現(xiàn)象?；疾∧肛i主要表現(xiàn)為皮膚發(fā)紅、精神沉郁、發(fā)熱、食欲不振、嗜睡和急性死亡，同時伴隨流產(chǎn)。本實驗室取該豬場病死豬的脾臟和肺臟進行細菌分離和PCR鑒定，對該起疫情進行了確診，同時采集流產(chǎn)母豬和同欄舍表現(xiàn)正常母豬的血清進行ELISA IgG抗體檢測。

1 材料

1.1 病料與血清

病料：采自病死豬脾臟和肺臟；血清：10份流產(chǎn)母豬血清（編號1～10），10份同欄舍正常母豬血清（編號11～20）。陽性血清：采自注射過豬丹毒疫苗的豬只；陰性血清：采自未接種過豬丹毒疫苗且未感染過豬丹毒的豬只。

1.2 主要試劑

哥倫比亞血瓊脂平板：購于江門試劑公司；PCR酶Mix3.0：購于天恩澤生物技術(shù)有限公司；山羊抗豬酶標二抗：購于KPL公司。

2 方法

2.1 細菌分離培養(yǎng)及PCR鑒定

2.1.1 細菌分離培養(yǎng) 用無菌接種環(huán)鉤取病死豬的脾臟和肺臟，接種至血瓊脂平板上。每個臟器接種1個血瓊脂平板。將血瓊脂平板置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)1 d，觀察菌落大小及形態(tài)，從中挑取單菌落純化并進行革蘭氏染色鏡檢。

2.1.2 細菌PCR鑒定 參照文獻[1]合成豬丹毒16S rRNA檢測引物。上游引物Ery-16S-F：TGACATACCGCGCAAAAGCA；下游引物Ery-16S-R：GGCTCCCTCCTAGTAAACTA。引物擴增的目的條帶大小為472 bp。PCR程序：預(yù)變性94 ℃ 10 min，變性 94 ℃ 30 s，退火 53 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，再延伸72 ℃ 7 min。PCR體系：Mix 25 μL、純水 21 μL、上游引物 1 μL、下游引物1 μL、模板2 μL。從純化過后的血瓊脂板中，挑取單菌落用純水稀釋，將稀釋后的菌液作為樣品模板。陽性對照模板為本實驗室分離鑒定得到的豬丹毒絲菌，陰性對照模板為純水。

2.2 IgG抗體ELISA檢測

從該豬場的同一棟欄舍中，隨機抽取10頭流產(chǎn)母豬和10頭正常母豬進行采血，參照劉曉波[2]建立的豬丹毒絲菌IgG抗體ELISA檢測方法，對采集的血清進行檢測。當S/P≥0.20時，判定樣品為陽性。

3 結(jié)果

3.1 細菌分離培養(yǎng)

細菌分離結(jié)果顯示，在血瓊脂平板上均長出了微小的環(huán)形半透明單菌落（直徑為0.1～0.5 mm），且菌落周圍伴有溶血現(xiàn)象。從純化過的血瓊脂平板中，挑取單菌落進行革蘭氏染色鏡檢，在顯微鏡中看到大量革蘭氏陽性短小桿菌，其大小與形態(tài)與豬丹毒絲菌極其相似（圖1）。

3.2 細菌PCR鑒定

圖1 豬丹毒絲菌革蘭氏染色鏡檢

以純化后的單菌落為模板，用豬丹毒絲菌16S rRNA檢測引物進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴增出來的特異性條帶大小為472 bp左右，與預(yù)期片段大小一致，確定為豬丹毒絲菌陽性（圖2）。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳

3.3 IgG抗體ELISA檢測

流產(chǎn)母豬及同欄舍正常母豬的豬丹毒絲菌IgG抗體ELISA檢測結(jié)果顯示（表1），10份健康經(jīng)產(chǎn)母豬中，只有1份樣品為IgG抗體陽性，陽性率為10%；10份流產(chǎn)母豬樣品中，有9份為陽性，陽性率為90%，其S/P平均值為1.280 7。

表1 流產(chǎn)母豬及同欄舍正常母豬血清IgG抗體ELISA檢測結(jié)果

4 分析與討論

該豬場母豬未免疫過豬丹毒疫苗。2017年8月底，該豬場從發(fā)生過豬丹毒疫情的豬場引進了20頭母豬，次日就有9頭引進母豬死亡。9月初，該豬場突然出現(xiàn)懷孕母豬流產(chǎn)、死亡現(xiàn)象。在疫情暴發(fā)1個月內(nèi)，該豬場共有94頭母豬流產(chǎn)，104頭母豬死亡。發(fā)病豬群臨床癥狀與豬丹毒感染一致。經(jīng)細菌分離及革蘭氏染色鏡檢，后挑取單菌落作為模板，用豬丹毒16S rRNA檢測引物進行PCR擴增，最終確定該菌株為豬丹毒絲菌。

為了解該豬場豬丹毒絲菌的感染情況，隨機采集10份流產(chǎn)母豬血清和10份同欄舍正常母豬血清進行豬丹毒絲菌IgG抗體ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)母豬陽性率高達90%，S/P平均值為1.280 7，而正常經(jīng)產(chǎn)母豬陽性率僅為10%。在確診病原之后，對發(fā)病豬群用大劑量青霉素肌注治療（每次每頭豬2000萬IU）連續(xù)用藥3 d，但效果不佳，后改用頭孢噻呋鈉注射液（每頭豬每天用量4～5g）肌注，并用阿莫西林粉和恩諾沙星可溶粉拌料，病情逐漸減輕，母豬流產(chǎn)得到控制。結(jié)合細菌分離鑒定和IgG抗體檢測結(jié)果以及抗生素治療效果，證實該起疫情由豬丹毒絲菌感染所致。

豬丹毒絲菌在自然界中廣泛存在，各種日齡、品種和性別的豬均可感染。豬丹毒的臨床表現(xiàn)形式包括急性型、亞急性型和慢性型，其中急性型豬丹毒可以導致母豬流產(chǎn)。但在PubMed數(shù)據(jù)庫中，關(guān)于豬丹毒引起母豬流產(chǎn)的報道很少，而在國內(nèi)的CNKI數(shù)據(jù)庫中，也沒有類似報道。本起由豬丹毒引起的母豬流產(chǎn)、死亡案例，希望引起廣大養(yǎng)殖戶對豬丹毒的重視。目前，對于豬丹毒最有效的防護措施是疫苗免疫接種，因此建議豬場將豬丹毒列入免疫計劃，并且加強飼養(yǎng)管理，搞好環(huán)境衛(wèi)生，定期消毒，從而減少因豬丹毒導致的經(jīng)濟損失。