于曉慧，田似報，王 琳，崔治中，常 爽，趙 鵬，李 陽

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266114；2.北京中科基因技術(shù)有限公司，北京 100190；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東泰安 271018）

鸚鵡喙羽?。≒sittacine beak and feather disease，PBFD）是鸚鵡目前最常見的疾病，早于20世紀70年代在澳大利亞多種野生鳳頭鸚鵡（Cockatoo）中被發(fā)現(xiàn)[1]，1981年被Perry首次命名。Ritchine等[2]報道該病的臨床表現(xiàn)有最急性型、急性型和慢性型3種。

目前，PBFD仍是鸚鵡最重要的傳染病[3]之一。隨著鳥類全球貿(mào)易的發(fā)展，該病已傳播至世界各地，有60多種野生或者籠養(yǎng)鸚鵡能夠患該病[4]。我國大陸地區(qū)首例PBFD病例是2008年在山東省青島市某集約化虎皮鸚鵡養(yǎng)殖基地被發(fā)現(xiàn)的[5-6]。至今該病仍在我國某些地區(qū)散發(fā)流行。

PBFD的病原是鸚鵡喙羽病病毒（PBFDV），屬圓環(huán)病毒科，是一個已知的最小病毒，直徑14～17 nm，呈二十面體對稱，無囊膜[7]。PBFDV為單鏈的DNA基因組，約有2 kb，包含2個主要的開放閱讀框（ORF）：1個編碼復(fù)制相關(guān)蛋白（Rep），1個編碼衣殼蛋白（CP）[7-8]，其他ORF編碼基因的功能尚不清楚。

目前，PBFD主要根據(jù)臨床表現(xiàn)和組織學(xué)觀察作出初步診斷，應(yīng)用免疫組化或PCR可進行確診。為了提高分子生物學(xué)方法檢測PBFDV的敏感性和特異性，本研究通過用地高辛（DIG）標記成核酸探針，建立了一種快速、靈敏、特異性強的PBFDV檢測方法。對鑒定陽性的PBFDV進行了完整的基因組測序，并對其遺傳特性和進化程度進行了分析。

1 材料與方法

1.1 病毒和病料

PBFDV參考株由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽腫瘤病實驗室鑒定、保存。病料來源于山東省某鸚鵡養(yǎng)殖場的虎皮鸚鵡。收集病死鸚鵡的肝臟、腎臟、心臟等病料組織，并進行研磨，使用組織基因組DNA提取試劑盒（OMEGA），按說明書提取細胞總DNA，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 核酸探針制備及靈敏度和特異性檢驗

利用本實驗室保存的參考株CP基因質(zhì)粒，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的PBFDV全基因組序列，設(shè)計如下引物，由上海生物工程有限公司合成探針：PBF1：5′-CAGAACATATCGAAATGG-3′和 PB-R1：5′-TGCAGATATCAAGACTGCC-3′。 按 照 羅 氏 公司PCR DIG Probe Synthesis Kit說明書合成針對PBFDV的DIG標記探針。將定量好的參考株核酸進行梯度稀釋，按照文獻[9]介紹的方法進行核酸斑點雜交確定制備探針的靈敏度。另外，將本實驗室分離鑒定和制備保存的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組增生癥病毒（REV）、雞馬立克氏病病毒（MDV）、雞傳染性貧血病毒（CIAV）、禽白血病病毒（ALV）、雞呼腸孤病毒（ARV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）、禽多瘤病毒（APV）等的DNA，使用所制備探針，按照文獻[9]介紹方法進行核酸斑點雜交確定制備探針的特異性。

1.3 使用核酸探針檢測鸚鵡病料中PBFDV核酸

參照已發(fā)表的PBFDV全基因組序列，設(shè)計用于檢測PBFDV的引物，并由上海生物工程有限公司合成。上下游引物分別為：PB-F2：5′-GTGTCCTTGTCCTTCTGGCA-3′和 PB-R2：5′-CGTCTTGCCATCTTACAGTCTTAT-3′。應(yīng)用 25 μL 體系，按照如下反應(yīng)條件進行擴增：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共32個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。取2 μL上述PCR產(chǎn)物點樣于尼龍膜上，按照文獻[9]介紹方法，使用制備探針進行核酸斑點雜交檢測。

1.4 陽性樣品中PBFDV全基因組克隆測序和序列分析

取斑點雜交檢測為陽性的病料組織基因組DNA，參考已發(fā)表的PBFDV全基因組序列，設(shè)計和合成了2對引物（表1），分段擴增2段相互重疊的片段。按TaKaRa Ex Taq酶試劑盒（TaKaRa，Code No.RR001A）使用說明，用2對引物分別進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳鑒定并將目的條帶切下，然后使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit（OMEGA，USA）回收純化DNA；將 純 化 DNA 連 接 PMD-18T Vector（TaKaRa，Japan）后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，挑取單個菌落以Plasmid Mini Kit（OMEGA，USA）提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，最后將陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序。

表1 用于擴增PBFDV全基因組序列的引物

1.5 序列比對和遺傳進化分析

使用DNA Star軟件，將分別測序的兩段核苷酸序列進行拼接以獲得病毒的全基因組序列，然后將其與GenBank中已發(fā)表的代表性PBFDV參考序列（表2）進行全基因組序列比對，分析分離毒株與不同參考毒株間的核苷酸同源性，并繪制分子遺傳進化樹。

表2 用于繪制PBFDV毒株分子遺傳進化樹的參考株

2 結(jié)果

2.1 CP基因的PCR擴增和探針標記

以PBFDV-CP質(zhì)粒為模板，用PB-R1和PB-F1引物擴增CP基因片段，出現(xiàn)預(yù)期830 bp的目的條帶。標記的探針從電泳圖譜上看，明顯滯后于普通dNTP擴增產(chǎn)物條帶，說明標記成功（圖1）。

2.2 PBFDV核酸探針靈敏性檢測

圖1 PBFDV探針標記結(jié)果

將PBFDV陽性對照核酸稀釋至1 000、100、10、1、0.1 pg/μL，用經(jīng)檢驗合格SPF雞胚制備的CEF提取的DNA作為陰性對照，分別點樣在尼龍膜上，使用制備的PBFDV核酸探針進行斑點雜交。結(jié)果顯示：PBFDV特異性核酸片段為1 000、100、10、1 pg時，核酸顯色，呈陽性反應(yīng)；PBFDV特異性核酸片段為0.1 pg時及陰性對照核酸均不顯色，呈陰性反應(yīng)（圖2）。敏感性統(tǒng)計結(jié)果表明，該探針可檢測到1 pg的PBFDV特異性核酸片段（表3），表明本檢測方法具有較好的敏感性。

圖2 PBFDV核酸探針靈敏性檢測結(jié)果

表3 PBFDV-CP探針的靈敏性檢測信號強度統(tǒng)計結(jié)果

2.3 PBFDV核酸探針特異性檢測

將已知背景的REV-DNA、MDV-DNA、CIAV-DNA、ALV-DNA、ARV-DNA、IBV-DNA、APV-DNA以及用經(jīng)檢驗合格SPF雞胚制備的CEF提取的DNA作為陰性核酸，以PBFDV-CP為陽性核酸分別點樣在尼龍膜上，使用制備的PBFDV核酸探針進行斑點雜交。結(jié)果顯示，僅有PBFDVCP陽性核酸顯色，呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，而陰性核酸和REV、MDV、CIAV、ALV、ARV、IBV以及APV的DNA均不顯色，呈陰性反應(yīng)（圖3），表明合成的核酸探針特異性強，僅會識別PBFDV陽性核酸，而不識別其他非PBFDV核酸成分。

圖3 PBFDV探針的特異性檢測結(jié)果

2.4 應(yīng)用制備探針檢測病料中的PBFDV

山東省某鸚鵡養(yǎng)殖場的虎皮鸚鵡幼雛出現(xiàn)體質(zhì)量下降，脫羽和羽毛變形萎縮，鳥喙變形及胸腺結(jié)構(gòu)變異等癥狀，死亡率顯著升高。收集病死鸚鵡的肝臟、腎臟、心臟等病料組織進行研磨，提取細胞總DNA。用本研究建立的方法共檢測了9份臨床樣品，其中檢出陽性2份（圖4）。

圖4 臨床樣品PCR產(chǎn)物斑點雜交檢測結(jié)果

2.5 陽性樣品中PBFDV全基因組序列測定與進化分析

利用DNA star軟件對2個陽性樣品的2個PCR片段克隆的測序結(jié)果進行剪輯和拼接，完成了2個PBFDV全基因組的核苷酸序列，二者的核苷酸序列同源性為100%，可以確定為同一毒株，命名為SDZB01（GenBank accession No.KU596572）。該序列全長2003 bp，與國內(nèi)外已發(fā)表的28株P(guān)BFDV分離株全基因的核苷酸同源性為81.5%～98.9%，其中與山東的QD-CN01株同源性最高為98.9%，與AF311301株同源性最低，只有81.5%。

選取測定的SDZB01株序列與GenBank收錄的28個PBFDV序列，繪制了以全基因組核苷酸序列為基礎(chǔ)的PBFDV毒株分子遺傳進化樹（圖5）。由進化樹可以看出，PBFDV與地理位置和宿主都具有一定的相關(guān)性。本研究的SDZB01株與分離自山東青島的QD-CN01株在同一個分支上，與分離自日本的MUJP6P株也在同一個分支上，宿主都是虎皮鸚鵡，表明該分離株與QD-CN01株之間有很強的親緣關(guān)系。

圖5 以全基因組核苷酸序列為基礎(chǔ)的PBFDV毒株分子遺傳進化樹

3 討論

目前建立的PCR法檢測PBFDV核酸靈敏度雖高，但有時會出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，使得檢測結(jié)果可信度不高，一般要將PCR產(chǎn)物連接到T載體上測序后才能做出最終判斷，這大大耗費了檢測時間，增加了檢測成本。地高辛標記DNA探針雜交檢測法具有特異性強、敏感性高、操作方便、檢測時間短、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點，是目前常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)。本研究建立了一種針對PBFDV的特異性核酸探針斑點雜交檢測方法，并通過一系列試驗，驗證了其可以檢測到1 pg的PBFDV核酸，并只對PBFDV核酸呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，而對REV、MDV、CIAV、ALV、ARV、IBV、APV的DNA呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，證明該PBFDV的核酸探針斑點雜交檢測方法具有較高的靈敏度和較強的特異性。

目前，已有對毒株及其分布區(qū)域之間關(guān)系的研究，證明不同地區(qū)的毒株間存在系統(tǒng)進化變異[8]。例如，德國、中國（大陸和臺灣）的分離株[10-11]以及新西蘭、澳大利亞和南非的BFDV分離株均存在變異[12]。南非的PBFDV分離株與世界其他地區(qū)的病毒分離株不同，與非洲和澳大利亞分離株的差異率為8.3%～10.8%。與之相反，澳大利亞和新西蘭分離株的相似性顯示，病毒和宿主間基因型相關(guān)性的演變加快了病毒在世界范圍的傳播[13]。本研究中的SDZB01株序列全長2003 bp，與國內(nèi)外已發(fā)表的28株P(guān)BFDV全基因組的核苷酸同源性為81.5%～98.9%，其中與中國大陸的QD-CN01株同源性高達98.9%。遺傳進化分析表明，該毒株與分離自山東青島的QD-CN01株和日本的MU-JP6P株在同一個分支上，且宿主都是虎皮鸚鵡，表明該株與QD-CN01株有很強的親緣關(guān)系。

我國具有多種多樣的鳥類和家禽，因此有效控制鳥類PBFDV感染是一個非常重要的問題。本研究建立了一種靈敏度更高、特異性更強的PCR產(chǎn)物斑點雜交檢測方法，用該方法對某養(yǎng)殖場疑似PBFDV病例進行初步臨床診斷應(yīng)用，并對鑒定的PBFDV進行全基因組序列及遺傳進化分析，這加深了對PBFDV進化途徑的了解，有助于PBFDV分子流行病學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域的進一步研究，對于預(yù)防和控制PBFDV感染有重要意義。