陸勤勤，劉 朔，蔣文明，侯廣宇，李金平，莊青葉，王素春，費(fèi)榮梅，陳繼明

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095；2.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

禽流感（Avian influenza，AI）是由流感病毒引起的禽類傳染病[1]。近年來，H9N2亞型和H7N9亞型流感病毒在我國家禽中引起較為嚴(yán)重的疫情，H7N9亞型病毒在我國還引起較多的人間感染病例[2-3]。為有效了解H9N2亞型和H7N9亞型流感的流行態(tài)勢、疫情風(fēng)險(xiǎn)以及病毒變異情況，2018年3—5月，在上海、江蘇等11個(gè)省市，開展了H9N2和H7N9亞型流感流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與耗材

QIAxtractor高通量核酸提取儀配套相關(guān)試劑、QIAxcel Advanced全自動(dòng)毛細(xì)管電泳分析儀配套試劑：購自QIAgen公司；HiScript II One Step RTPCR Kit：購自Vazyme公司；植絨拭子：購自深圳麥瑞科林科技有限公司。

1.2 樣品采集

2018年3—5月，在上海、江蘇、湖北、江西、廣東、廣西、云南、貴州、西藏、寧夏、黑龍江等11個(gè)省份，隨機(jī)選擇17個(gè)活禽批發(fā)市場、37個(gè)活禽零售市場、11個(gè)養(yǎng)禽場、1個(gè)散養(yǎng)戶、1個(gè)屠宰場，共67個(gè)場點(diǎn)，隨機(jī)采集4 792份樣品（每份樣品含1只禽的咽肛雙拭子樣品），其中雞3 736份、鴨703份、鵝131份、鴿222份，置于加有抗生素（259 mg/L慶大霉素、60 mg/L左旋氧氟沙星、60 mg/L阿奇霉素）的PBS-甘油采樣液中（pH7.2～7.6）保存，在4 ℃下運(yùn)輸和保存。

1.3 RNA提取

將采集的樣品10 000 r/min離心10 min，取上清液，用QIAxtractor高通量核酸提取工作站提取病毒RNA，?70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 HA和NA基因擴(kuò)增

按農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T772-2013），用HiScript II One Step RT-PCR Kit，對(duì)流感病毒血凝素（Hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）基因進(jìn)行RT-PCR檢測。引物序列見表1。RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，包括2×RT-PCR Buffer 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1.0 μL，Enzyme Mix 1.25 μL、ddH2O 6.25 μL、RNA 模 板3.0 μL。RT-PCR反應(yīng)條件為：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)（94 ℃變性30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min），最后 72 ℃延伸7 min[4]。按照QIAxcel全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀操作步驟，將RT-PCR的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，將陽性樣品送至青島睿博興科生物技術(shù)公司測序。

表1 HA和NA基因擴(kuò)增引物序列

1.5 序列分析

利用MAGE 5.0軟件中的Clustal W方法，將本試驗(yàn)中檢測到的病毒HA基因序列與參考株基因序列進(jìn)行比對(duì)，再選擇部分序列進(jìn)行譜系分析。譜系分析的參數(shù)設(shè)置如下：采用Neighbor-joining計(jì)算方法，核苷酸變異設(shè)為Kimura 2-parameter模式，各位點(diǎn)變異速率設(shè)為Gamma分布（α=1.0）。Bootstrap值的計(jì)算設(shè)置為1 000個(gè)重復(fù)。

1.6 顯著性檢驗(yàn)

對(duì)本次調(diào)查的陽性率，按照卡方檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05判為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 H7N9病毒檢測

在4 792份樣品中，未檢出H7N9亞型病毒。

2.2 H9N2病毒檢測

2.2.1 宿主分布 在4 792份樣品中，檢測出H9N2亞型病毒 1 208份，樣品總陽性率為32.34%（1 208/4 792），場點(diǎn)總陽性率為80.60%（54/67）。其中，雞樣品陽性率為29.18%（1 090/3 736），鴨為12.23%（86/703），鵝為1.53%（2/131），鴿為13.51%（30/22）。雞樣品H9N2亞型陽性率顯著高于其他宿主樣品（P＜0.05，圖1）。

圖1 各宿主樣品H9N2亞型病毒陽性率分布

2.2.2 區(qū)域分布 11個(gè)省份中，除黑龍江省外，其余10省份均存在H9N2亞型病毒感染（圖2），其中江西、貴州、江蘇、西藏的樣品檢出率較高，分別為54.79%（263/480）、53.54%（257/480）、44.42%（191/430）、40.07%（199/297）； 湖北和云南次之，分別為24.20%（98/405）和21.67%（104/480）；寧夏、上海、廣東、廣西檢出率較低，分別為13.75（66/480）、11.33%（34/300）、10.21%（49/480）、5.63%（27/480）。

圖2 各省樣品H9N2亞型病毒檢出率分布

2.2.3 場點(diǎn)分布 活禽批發(fā)市場樣品陽性率為29.70%（605/2 037），場點(diǎn)陽性率為100%（17/17）；活禽零售市場樣品陽性率為27.09%（592/2 185），場點(diǎn)陽性率為96.40%（35/37）；養(yǎng)禽場樣品陽性率為2.29%（11/480），場點(diǎn)陽性率為18.20%（2/11）；散養(yǎng)戶和屠宰場未檢測到陽性樣品（圖3）?；钋菔袌觯êl(fā)和零售的活禽市場）的場點(diǎn)陽性率為96.30%，顯著高于其他場點(diǎn)（含養(yǎng)禽場、散養(yǎng)戶、屠宰場）的15.38%（P＜0.05）。

圖3 各類場點(diǎn)H9N2亞型病毒陽性率分布

2.2.4 時(shí)間分布 本實(shí)驗(yàn)室分別于每年的3—5月和10—12月，開展兩次全國禽流感流行病學(xué)調(diào)查（圖4）。結(jié)合這些調(diào)查監(jiān)測結(jié)果，可以看出H9N2亞型病毒在我國長期處于較高的流行態(tài)勢，上半年的感染率一般比下半年低。這估計(jì)是因?yàn)?—5月的溫度高于10—12月，不利于病毒傳播。值得注意的是，2018上半年H9N2亞型病毒檢出陽性率顯著高于往年同期檢測值（P＜0.05），達(dá)到近年來最高點(diǎn)，提示當(dāng)前我國家禽H9N2亞型病毒染風(fēng)險(xiǎn)有進(jìn)一步增大趨勢。

圖4 2013—2018年H9N2亞型病毒流行變化趨勢

2.3 基因序列分析

本次調(diào)查檢出的H9N2亞型病毒的HA蛋白裂解位點(diǎn)處的氨基酸序列為PSRSSRGLF，為典型的低致病性流感病毒分子特征。這些序列第226位氨基酸都為酪氨酸（L），能夠結(jié)合人樣的α2，6-唾液酸受體。選取39株代表我國分離到的不同譜系H9N2亞型病毒序列和6個(gè)我國普遍使用疫苗毒株的HA基因序列作為參考序列，在檢出的1 208株H9N2亞型病毒中，隨機(jī)篩選出123條序列與參考序列進(jìn)行對(duì)比和遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)檢出的毒株均屬于h9.4.2.5分支。該分支為2007年以來我國H9亞型病毒主要流行分支，未表現(xiàn)出明顯的地域性差異。檢出的部分離株HA基因的遺傳進(jìn)化樹見圖5。

3 討論

本次調(diào)查未檢出H7N9亞型病毒。該病毒自2013年在我國家禽中出現(xiàn)后，持續(xù)流行于我國家禽群體中。在2016年下半年至2017年上半年期間，該病毒流行率上升顯著，引起的人間病例數(shù)也驟然增加，并且分化出高致病性H7N9亞型病毒。2017年秋季，我國開始使用H5和H7二聯(lián)雙價(jià)疫苗對(duì)各類家禽進(jìn)行強(qiáng)制免疫，使得該病毒引起的家禽感染率和人間病例數(shù)量迅速下降。本次調(diào)查未檢出該亞型病毒，也支持了疫苗免疫導(dǎo)致該亞型病毒流行率顯著下降之推斷[5]?？紤]到2018年上半年僅發(fā)生2起H7N9家禽疫情，預(yù)計(jì)今后，該病毒將繼續(xù)維持較低的流行態(tài)勢，但存在不確定性：既可能因?yàn)橐呙缑庖咝Ч?、夏季病毒流行率低、野禽中病毒?chǔ)存數(shù)量有限等原因，導(dǎo)致該病毒被清除，也可能因?yàn)樵摬《境霈F(xiàn)逃避疫苗免疫的變異株，或者出現(xiàn)適應(yīng)水禽的變異株，導(dǎo)致該病毒繼續(xù)流行。

與往年調(diào)查一致，本次調(diào)查繼續(xù)提示，我國H9N2亞型病毒分布廣泛，在家禽中感染率高，尤其是活禽市場，這與既往調(diào)查結(jié)果相符[6-9]。雞樣品的H9N2亞型陽性率最高，可能與該病毒發(fā)生更適應(yīng)于雞的突變有關(guān)[8-9]。本次調(diào)查顯示，江蘇、江西、貴州、西藏的H9N2病毒樣品陽性率較高，說明這些省份H9N2亞型病毒流行較為嚴(yán)重，當(dāng)然也可能與樣品在宿主、場所等方面存在差異有關(guān)。本次調(diào)查顯示，2018年的H9N2亞型病毒陽性率較往年顯著升高，說明近年來H9N2亞型病毒的防控效果不佳，也可能是與樣品在宿主、場所、采樣時(shí)間等方面存在差異有關(guān)。

圖5 部分H9N2亞型病毒分離株HA基因進(jìn)化樹

本次檢出的H9N2病毒都屬于h9.4.2.5分支，說明目前H9亞型病毒的流行分支還沒有發(fā)生改變，基因特征仍表現(xiàn)為低致病性[9]。

基于以上調(diào)查結(jié)果，建議繼續(xù)加強(qiáng)活禽市場管理，大力推進(jìn)活禽集中屠宰和冷鮮上市[10]，繼續(xù)使用H5和H7二聯(lián)雙價(jià)疫苗對(duì)各類家禽進(jìn)行免疫，同時(shí)加強(qiáng)病原的流行病學(xué)調(diào)查監(jiān)測。對(duì)于H9N2亞型病毒，需要研究改進(jìn)原有的防控策略，有效降低其流行率。