， ，， ，

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

抗生素對(duì)人們生活的影響日益得到重視，除了抗生素不合理使用造成的危害以外，環(huán)境中的抗生素、小劑量抗生素對(duì)人體健康的影響都是值得研究的問(wèn)題[1-3]。腸道菌群是維系人體內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在正常情況下，腸道菌群與宿主共同維持微生態(tài)平衡，保護(hù)人體的健康。當(dāng)受到外界因素如飲食狀況、心理壓力、抗生素等影響時(shí)，腸道菌的種類(lèi)和數(shù)量會(huì)發(fā)生一系列變化。目前，腸道菌群失調(diào)已被證明與多種疾病有關(guān)，如難辨梭狀芽孢桿菌感染、炎癥性腸病、癌癥和2型糖尿病等[4-6]?？股啬軌蝻@著改變腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，從而影響微生物的代謝和腸道健康。有研究表明：抗生素會(huì)影響小鼠體內(nèi)的代謝平衡[7]，多黏菌素E灌胃能夠誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)，且導(dǎo)致腸屏障功能損傷和細(xì)菌易位[8]。同時(shí),抗生素處理使小鼠腸道腸球菌增殖，改變了相關(guān)的腸道菌黏液層，降低了腸壁厚度[9]。

為了進(jìn)一步揭示抗生素對(duì)腸道菌群組成的影響及其作用機(jī)制，筆者擬采用經(jīng)典的頭孢曲松鈉造成抗生素相關(guān)性菌群失調(diào)模型，研究抗生素對(duì)腸道菌群組成及相關(guān)代謝的影響，為抗生素對(duì)機(jī)體代謝的影響研究提供參考，以期為評(píng)價(jià)抗生素對(duì)機(jī)體的副作用及抗生素用后的修復(fù)等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

20 只SPF級(jí) BALB/c小鼠，雌雄各半，體重(18±2) g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，寄養(yǎng)于浙江工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房?jī)?nèi)，小鼠飼料營(yíng)養(yǎng)成分如表1所示；頭孢曲松鈉購(gòu)自山東潤(rùn)澤制藥有限公司；乙酸、丙酸、丁酸和戊酸均購(gòu)自Sigma-Aldrich；小鼠脂多糖ELISA試劑盒購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

表1 小鼠飼料營(yíng)養(yǎng)成分Table 1 Nutrient contents of mice fodder

1.2 動(dòng)物分組與處理

20 只BALB/c小鼠，按隨機(jī)原則進(jìn)行分組，CK組雌、雄鼠各5 只，模型組(抗生素組)雌、雄鼠各5 只。參照文獻(xiàn)[10]， CK組小鼠自由飲用無(wú)菌水，自由攝取食物。模型組小鼠灌胃 125 mg/mL 的頭孢曲松鈉溶液 0.2 mL/次(相當(dāng)于成人正常劑量的10倍)，每天2次，時(shí)間間隔 6 h，連續(xù)灌胃6 d。在0 d和6 d收集小鼠新鮮糞便，- 20 ℃ 保存?zhèn)溆?。采用高通量測(cè)序測(cè)定腸道菌群組成，分析抗生素所致小鼠腸道菌群組成的影響。小鼠處死前禁食 6～8 h，眼球取血，脫頸椎處死。血液4 000 r/min，離心10 min，取出上清血清，-20 ℃ 保存。

1.3 DNA提取

每只小鼠收集300 mg的糞便樣品，然后同組樣品混合起來(lái)，共有4個(gè)混合樣品用于DNA提取。即對(duì)照組(CK組)和頭孢曲松鈉組(CRO組)分別在0 d(CK1和CRO1)和6 d(CK2和CRO2)收集的小鼠糞便。利用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒從糞便中提取混合宏基因組DNA。

1.4 高通量測(cè)序和生物學(xué)分析

首先將提取得到的腸道DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和純化回收，然后利用Qubit 2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量，以方便按照1︰1的等量混合后測(cè)序。

1.4.1 原始序列數(shù)據(jù)

Illumina MiseqTM得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列，其中包含測(cè)序序列的序列信息以及其對(duì)應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量信息。

1.4.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

Miseq測(cè)序序列中含有barcode序列，以及測(cè)序時(shí)加入的引物和接頭序列。首先需要去除引物接頭序列，將成對(duì)的序列拼接成一條序列，然后按照barcode標(biāo)簽序列識(shí)別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對(duì)各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。

1.4.3 去除嵌合體及非特異性擴(kuò)增序列

在PCR反應(yīng)過(guò)程中，會(huì)由于延伸不完全產(chǎn)生一些嵌合體。同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一些非特異性擴(kuò)增序列。為了保證信息分析質(zhì)量，必須對(duì)其進(jìn)行剔除。使用Usearch去除預(yù)處理后序列中非擴(kuò)增區(qū)域序列，而后對(duì)序列進(jìn)行測(cè)序錯(cuò)誤校正，并調(diào)用uchime進(jìn)行鑒定嵌合體。隨后，再將去除嵌合體的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)代表性序列進(jìn)行blastn比對(duì)，低于閾值的比對(duì)結(jié)果認(rèn)為是靶區(qū)域外序列，并剔除掉該部分序列。

1.4.4 腸道菌群組成的生物學(xué)分析

眾多序列按其序列間的距離進(jìn)行聚類(lèi)，然后根據(jù)序列與序列間的相似性當(dāng)作域值分為操作分類(lèi)單元(OTU)，一般域值的序列相似性設(shè)定為 0.97，則被認(rèn)為可能屬于屬。對(duì)處理后序列進(jìn)行物種分類(lèi)，采用的軟件為 RDP classifier，RDP classifier是基于 Bergey’s taxonomy，采用 Naive Bayesian assignment 算法對(duì)每條序列在genus 水平上計(jì)算其分配到此 rank 中的概率值，一般概率值大于 08，即 RDP 分類(lèi)閾值，則說(shuō)明此分類(lèi)結(jié)果可信(測(cè)序片段長(zhǎng)度<250 時(shí)可適當(dāng)調(diào)低此值到 0.5，如只測(cè) V3，V6，V4 區(qū))。Bergey’s taxonomy分為6層，它們依次為域 (domain)、門(mén) (phylum)、綱 (class)、目 (order) 、科 (family)和屬 (genus)。本實(shí)驗(yàn)主要在門(mén)綱目科屬水平上進(jìn)行優(yōu)勢(shì)菌群的分析，探索抗生素對(duì)小鼠腸道菌群組成的影響。

1.5 小鼠糞便中短鏈脂肪酸的測(cè)定

取100 mg糞便樣品置于10 mL離心管中，加入1.6 mL去離子水溶解，渦旋振蕩2 min鐘，加入 0.4 mL的硫酸(50%硫酸溶液)和 1.5 mL乙醚，250 r/min的搖床中搖晃 45 min，然后 3 000 r/min離心5 min。取上清液于干凈的試管中，加入無(wú)水氯化鈣脫水，過(guò)0.22 μm濾膜，乙醚定容至1 mL進(jìn)樣安捷倫氣相色譜檢測(cè)。

色譜條件：色譜柱為菲羅門(mén) ZB-FFAP；程序升溫100 ℃保留 2 min，8 ℃升到 240 ℃保持 10 min后運(yùn)行 230 ℃ 10 min；進(jìn)樣口為250 ℃；FID為350 ℃；以N2為載氣，流速為1.69 mL/min。

1.6 小鼠血清中脂多糖的測(cè)定

采用小鼠(Mouse) 脂多糖ELISA檢測(cè)試劑盒，操作如下：1) 從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4 ℃；2) 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；3) 樣本孔先加待測(cè)樣品20 μL，再加樣本稀釋液30 μL；空白孔不加；4) 除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min；5) 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次；6) 每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

兩組之間的差異用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。兩組以上的數(shù)據(jù)采用單因素方差進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 頭孢曲松鈉灌胃對(duì)小鼠體重的影響

如圖1所示，與CK組相比，抗生素灌胃后小鼠體重?zé)o顯著性變化，體重增加在正常范圍內(nèi)。

圖1 各組小鼠體重變化Fig.1 Weight changes of mice

2.2 頭孢曲松鈉對(duì)小鼠腸道菌群組成的影響

頭孢曲松鈉對(duì)小鼠腸道菌群組成的影響如表2所示。

表2 頭孢曲松鈉對(duì)小鼠腸道菌群組成的影響 1)Table 2 Effects of ceftriaxone sodium on intestinal flora in mice

注：1) CK為對(duì)照組；CRO為頭孢曲松鈉組；1為頭孢曲松鈉處理前；2為頭孢曲松鈉處理后。

2.2.1 頭孢曲松鈉對(duì)小鼠腸道菌群門(mén)水平的影響

由表2可知：實(shí)驗(yàn)前后變化最大的是擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)。CK組實(shí)驗(yàn)前后擬桿菌門(mén)的數(shù)量增加了12.68%，而頭孢曲松鈉組實(shí)驗(yàn)前后，擬桿菌門(mén)的數(shù)量減少了32%；頭孢曲松鈉組實(shí)驗(yàn)前后厚壁菌門(mén)豐度增加了25.43%，CK組實(shí)驗(yàn)前后厚壁菌門(mén)豐度降低了10.22%。頭孢曲松鈉對(duì)擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)的影響超出了CK組變化范圍。

小鼠腸道菌群中主要的優(yōu)勢(shì)門(mén)為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)，這三類(lèi)細(xì)菌門(mén)的豐度值占總菌群數(shù)的97%以上。擬桿菌門(mén)可以消化復(fù)雜的碳水化合物，維持腸道正常生理，并且在免疫系統(tǒng)起著重要的作用[11]。與CK組相比，頭孢曲松鈉組灌胃后引起擬桿菌門(mén)減少。擬桿菌綱(Bacteroidia)、擬桿菌目(Bacteroidales)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)和擬桿菌屬(Bacteroide)都屬于擬桿菌門(mén)，且結(jié)果與擬桿菌門(mén)相似(表2)，表明頭孢曲松鈉灌胃能抑制益生菌(擬桿菌綱、擬桿菌目、擬桿菌科和擬桿菌屬)生長(zhǎng)。厚壁菌門(mén)被認(rèn)為與肥胖、心血管疾病、糖尿病和慢性腸道炎癥的發(fā)生有關(guān)，肥胖患者中厚壁菌門(mén)比例明顯升高，而擬桿菌門(mén)比例明顯下降[12]。與CK組相比，頭孢曲松鈉灌胃后導(dǎo)致小鼠厚壁菌門(mén)豐度明顯升高，說(shuō)明了抗生素能夠造成腸道菌群紊亂。尹金寶研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素暴露兩周后，造成小鼠腸道微生物中擬桿菌門(mén)比例下降，厚壁菌門(mén)比例提高[13]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，說(shuō)明了抗生素對(duì)腸道菌群的影響可能存在相似性。

2.2.2 頭孢曲松鈉對(duì)小鼠腸道菌群綱水平的影響

由表2可知：實(shí)驗(yàn)前后豐度變化最大的是擬桿菌綱(Bacteroidia)和梭菌綱(Clostridia)。頭孢曲松鈉組實(shí)驗(yàn)前后，擬桿菌綱的豐度降低了32.05%，CK組實(shí)驗(yàn)前后擬桿菌綱的豐度增加了12.67%；頭孢曲松鈉組實(shí)驗(yàn)前后梭菌綱豐度增加了21.05%，CK組實(shí)驗(yàn)前后梭菌綱豐度降低了11.89%。頭孢曲松鈉對(duì)擬桿菌綱和梭菌綱的影響超出了CK組變化范圍。梭菌綱、梭菌目(Clostridiales)屬于厚壁菌門(mén)，Kalia等研究發(fā)現(xiàn)，某些梭菌菌株會(huì)產(chǎn)生一些致命的毒素[14]，如艱難梭菌感染是導(dǎo)致抗生素相關(guān)性腹瀉的最重要因素之一[15]，與CK組相比，頭孢曲松鈉灌胃后導(dǎo)致小鼠梭菌綱、梭菌目豐度升高，促進(jìn)了致病菌的產(chǎn)生。

2.2.3 頭孢曲松鈉對(duì)小鼠腸道菌群目水平的影響

由表2可知：實(shí)驗(yàn)前后影響最大的是梭菌目和擬桿菌目(Bacteroidales)。頭孢曲松鈉組實(shí)驗(yàn)前后，擬桿菌目降低了32.05%，CK組實(shí)驗(yàn)前后擬桿菌目的豐度增加了12.67%；頭孢曲松鈉組實(shí)驗(yàn)前后梭菌目豐度增加了21.04%，CK組實(shí)驗(yàn)前后梭菌目豐度降低了11.88%。頭孢曲松鈉對(duì)梭菌目和擬桿菌目的影響超出了CK組變化范圍。

2.2.4 頭孢曲松鈉對(duì)小鼠腸道菌群科水平的影響

由表2可知：實(shí)驗(yàn)前后擬桿菌科(Bacteroidaceae)變化明顯。頭孢曲松鈉組實(shí)驗(yàn)前后擬桿菌科豐度降低了9.94%，CK組實(shí)驗(yàn)前后擬桿菌科豐度下降了0.36%。

2.2.5 頭孢曲松鈉對(duì)小鼠腸道菌群屬水平的影響

在屬水平上各樣本菌群豐度值與細(xì)菌總數(shù)的比值見(jiàn)表2，其中實(shí)驗(yàn)前后擬桿菌屬(Bacteroides)和unclassified變化明顯。頭孢曲松鈉組實(shí)驗(yàn)前后擬桿菌屬下降了9.94%，CK組實(shí)驗(yàn)前后下降了0.36%。頭孢曲松鈉組實(shí)驗(yàn)前后unclassified豐度增加了15.55%，CK組實(shí)驗(yàn)前后下降了2.5%。unclassified為未分類(lèi)菌，其生理作用仍不清楚。

2.3 頭孢曲松鈉對(duì)小鼠糞便中短鏈脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

短鏈脂肪酸是腸道微生物通過(guò)發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。短鏈脂肪酸對(duì)哺乳動(dòng)物能量代謝等各方面具有有益作用[16]。短鏈脂肪酸在結(jié)腸腔內(nèi)不僅可作為腸黏膜細(xì)胞的主要能量來(lái)源，還可以減少促炎因子的生成，降低結(jié)腸炎癥的發(fā)生。小鼠糞便中短鏈脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖2所示。乙酸、丙酸、丁酸和戊酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在頭孢曲松鈉處理后比對(duì)照組顯著降低，這表明抗生素灌胃后改變了腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致有益代謝產(chǎn)物的降低，如短鏈脂肪酸。作為腸道菌群重要的有益代謝產(chǎn)物，短鏈脂肪酸已被證實(shí)與糖尿病等代謝性疾病密切相關(guān)，而抗生素造成的腸道菌群紊亂，也可能與多種代謝性疾病存在潛在的相關(guān)性。

圖2 頭孢曲松鈉處理對(duì)小鼠糞便中短鏈脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effects of ceftriaxone treatment on the contents of SCFAs in mice feces

2.4 頭孢曲松鈉對(duì)小鼠血清中脂多糖濃度的影響

脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的一種物質(zhì)[17]。它可能是導(dǎo)致小鼠代謝性?xún)?nèi)毒素血癥、低度全身炎癥和胰島素抵抗的關(guān)鍵物質(zhì)[18]。腸黏膜屏障是腸道的生物屏障，能阻止有害物質(zhì)進(jìn)入血液，兩組小鼠血清中脂多糖濃度如圖3所示。頭孢曲松鈉處理后，小鼠血清中脂多糖濃度顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明抗生素處理對(duì)腸黏膜屏障造成了損傷。同時(shí)，頭孢曲松鈉灌胃引起的血清中脂多糖濃度增加，也會(huì)促進(jìn)炎癥及相關(guān)疾病的發(fā)生。

圖3 頭孢曲松鈉處理對(duì)小鼠血清中脂多糖濃度的影響Fig.3 Effects of ceftriaxone treatment on the concentration of LPS in mice serum

3 結(jié) 論

抗生素使用或暴露可引起腸道菌群紊亂，探索抗生素作用下腸道菌群組成的改變將有利于相關(guān)機(jī)制研究的深入開(kāi)展。本研究采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)頭孢曲松鈉灌胃前后小鼠腸道菌群組成的變化，發(fā)現(xiàn)頭孢曲松鈉會(huì)改變小鼠腸道菌群組成，造成腸道菌群紊亂，可導(dǎo)致小鼠腸道有害菌(梭菌綱、梭菌目)的豐度增加并抑制益生菌(擬桿菌綱、擬桿菌目、擬桿菌科和擬桿菌屬)生長(zhǎng)；而腸道菌群紊亂可導(dǎo)致短鏈脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降及脂多糖濃度升高，促進(jìn)炎癥的發(fā)生。因此，在腸道菌群研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步揭示抗生素對(duì)機(jī)體代謝的影響，探索抗生素相關(guān)性腸道菌群修復(fù)技術(shù)，都將是降低抗生素副作用的重要研究方向。