趙佳福 許厚強 宋書弦 段志強 陳祥

（1. 貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室 貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2. 貴州大學生命科學學院，貴陽550025；3. 貴州省大方縣農(nóng)牧局，大方 551600）

BLM解旋酶是人類RecQ解旋酶家族中的一員，具有RecQ解旋酶家族典型的結(jié)構(gòu)特征，在DNA的復制、重組、轉(zhuǎn)錄、修復、端粒的維持等細胞代謝過程中具有重要的作用［1］。研究表明，BLM基因的突變會導致Bloom綜合癥的發(fā)生［2］，患者遺傳不穩(wěn)定，并易患乳腺癌、肺癌、前列腺癌和惡性腫瘤等各種癌癥［3-8］，屬于高風險人群。目前，BLM基因已被定位于15q26.1區(qū)帶上，轉(zhuǎn)錄生成4.5 kb的mRNA，編碼一個由1 417個氨基酸殘基組成的分子量約為159 kD的蛋白［9］。已報道的資料顯示，BLM解旋酶主要包含鏈退火結(jié)構(gòu)域（Strand annealing domain，SA）、解旋酶結(jié)構(gòu)域（Helicase domain）、RecQ羧 基 端 結(jié) 構(gòu) 域（RecQ C-terminal domain，RQC）、解旋酶和RNA酶D羧基端結(jié)構(gòu)域（Helicase and RNaseD C-terminal domain，HRDC）和核定位信號結(jié)構(gòu)域（Nuclear localization signal domain，NLS），其中RecQ、RQC和HRDC位于BLM解旋酶氨基酸639-1 290位，見圖1。該區(qū)域具有類似BLM全酶的活性，但缺乏羧基端的核定位功能和氨基端鏈退火結(jié)構(gòu)域的相關功能［10-11］。目前已發(fā)表的文章大多以BLM642-1290的核心區(qū)域為研究對象，開展BLM解旋酶結(jié)構(gòu)與功能的研究。本實驗旨在克隆BLM解旋酶基因全長4 251 bp的CDS區(qū)域，構(gòu)建BLM解旋酶全基因的重組真核表達載體和重組原核表達載體，并研究其原核細胞中的表達水平，在真核細胞中的亞細胞定位情況，以及BLM基因超表達后，對細胞核定位相關基因Ran表達水平的影響，進一步為BLM解旋酶結(jié)構(gòu)與功能研究提供材料和奠定基礎。

圖1 人BLM解旋酶全酶結(jié)構(gòu)域示意圖

1 材料與方法

1.1 材料

JM109、BL21（DE3）感受態(tài)細胞、pMD19-T vector、DL10000、DL5000 DNA Marker、 限 制 性內(nèi)切酶及T4 DNA ligase（寶生物），PC3細胞、pEGFP-N3載體、pET-32a（實驗室儲存），DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒（Axygen），RNA 提取試劑盒（Omega），無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（QIAGEN），2×Taq PCR Master Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（康為），F(xiàn)uGENE? HD Transfection Reagent（Roche），10%胎牛血清、RPMI1640生長培養(yǎng)基（gibco）。抗His標簽鼠單克隆抗體、HRP標記山羊抗小鼠IgG抗體（康為），抗BLM蛋白鼠單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology），ECL超靈敏顯色試劑盒、TBSTw液封閉、彩虹Marker（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 由于BLM基因較長，為提高擴增效率，采用分段擴增的方式，進行BLM全基因的克隆。根據(jù)GenBank中登錄的BLM基因cDNA序列（NM_000057），采用 Primer Premier 5.0設計BLM1-1950，BLM1319-2735，BLM1-42513對引物，根據(jù)表達載體pET-32a載體圖譜和BLM基因全長序列的特點，分別在B1-F、B3-R中添加KpnI、XhoI酶切位點，3對引物擴增獲得的3條序列彼此間均具有部分重復序列，便于后續(xù)擴增BLM1-4251全長。此外 根 據(jù) GenBank中 人BLM（NM_000057）、RAN（NM_006325.4）、GAPDH（NM_001289 746.1）基因的cDNA序列，設計熒光定量PCR引物，見表1。

1.2.2BLM基因的克隆 收集對數(shù)生長期的前列腺癌PC3細胞，約5×106個，采用Omega公司 RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別擴增B1、B2、B3序列，EcoR I和NcoI分別單酶切B1和B3、雙酶切B2，膠回收目的片段后，T4DNA連接酶連接回收后，以回收產(chǎn)物為模板，采用B1-F、B3-R擴增BLM1-4251全長序列（圖2）；電泳檢測PCR產(chǎn)物，膠回收目的片段，并與pMD-19-T 載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞。由于目的片段較大，菌液PCR同樣分為B1、B2、B3三段進行檢測，最后將檢測正確的重組質(zhì)粒pMD-19-BLM送上海英駿生物技術(shù)公司測序鑒定。

表1 實驗所使用的引物

1.2.3 重組原核和重組真核表達載體的構(gòu)建 根據(jù)pET-32a（+）和pMD19-BLM載體酶切位點圖譜，分別采用KpnI和XhoI限制性內(nèi)切酶切割兩個質(zhì)粒，回收5 900 bp的pET-32a（+）載體和4 251 bp的BLM基因兩條目的條帶，16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，氨芐青霉素抗性平板篩選單克隆，挑取單克隆，搖菌并進行菌液PCR分段檢測和雙酶切檢測，最后將PCR和雙酶切鑒定均正確的pET-32a-BLM陽性菌株，以終濃度為25%的甘油進行-80℃保藏。同上，選擇Hind Ⅲ和BamHⅠ兩個限制性內(nèi)切酶進行雙酶切反應，膠回收4 700 bp的pEGFP-N3載體片段和4 251 bp的BLM基因目的片段，連接轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，采用含卡那霉素的抗性平板進行篩選，構(gòu)建重組真核表達載體pEGFP-N3-BLM。

圖2 BLM CDS區(qū)擴增方案示意圖

1.2.4 BLM解旋酶的在大腸桿菌中的表達分析 為摸索出BLM蛋白表達的最佳培養(yǎng)條件，按照培養(yǎng)溫度設為25℃和37℃兩組，每組設4個IPTG 濃度梯度，終濃度分別為0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、0.7 mmol/L和1.0 mmol/L，180 rpm條件下?lián)u菌5 h。5 h后，按照細菌蛋白抽提試劑盒說明裂解細胞，提取總蛋白，并分離上清和沉淀，同時設含空質(zhì)粒pET-32a（+）的菌株為對照組。6%分離膠進行SDS-PAGE分析，按彩虹Marker5 mL/孔、蛋白樣品30 mL/孔進行上樣，電壓：80 V 30 min，120 V 60 min，電泳結(jié)束后120 V 2.5 h轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBSTw液封閉10 min，抗His標簽鼠一抗4℃孵育過夜，HRP山羊抗小鼠二抗孵育1 h，DAB顯色，熒光化學發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）對Western-blot進行結(jié)果分析。

1.2.5 BLM解旋酶在PC3細胞中的亞細胞定位分析 首先采用PSORT II Prediction在線分析軟件對BLM解旋酶氨基酸序列進行分析，對其在細胞中可能的表達部位進行預測。然后將PC3細胞按照3×105/孔接種于6孔板中，37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長至80%時，按照FuGENE?HD Transfection Reagent的操作說明，將純化后的pEGFP-N3和pEGFP-N3-BLM兩個質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染PC3細胞，通過細胞轉(zhuǎn)染結(jié)合熒光共定位的方法對預測結(jié)果進行驗證。具體操作步驟：（1）首先棄去6孔板中培養(yǎng)基，用PBS清洗培養(yǎng)孔兩次，每孔加入2 mL的含血清不含抗生素的DMEM/F-12培養(yǎng)基，置于37℃、5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；（2）取6支無菌PCR管，每管先加入2 μg轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，再加入10 μL轉(zhuǎn)染試劑，移液器輕輕混勻，再加入100 μL Opti-MEM?輕輕混勻，室溫孵育30 min；（3）將轉(zhuǎn)染混合物對號加入6孔板中，十字交叉法輕輕振蕩混勻，繼續(xù)置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染細胞36 h后開始染核，具體操作步驟如下：（1）用PBS浸洗細胞3次，加入事先預冷的4%多聚甲醛固定細胞20 min；（2）PBS浸洗細胞3次，加入0.25%Triton X-100（PBS配制）室溫通透5 min；以下步驟需在暗處進行：（3）PBS浸洗細胞3次，吸干，滴加DAPI 37℃避光孵育5 min進行細胞核染色；（4）PBS 清洗3次，吸干多余液體，自然干燥后，熒光顯微鏡下觀察實驗結(jié)果；（5）采用PhotoshopCS3軟件將融合蛋白熒光圖譜與對應的細胞核熒光圖譜進行Merge，通過觀察分析兩者的熒光共定位情況，判斷融合蛋白的亞細胞定位。

1.2.6 qRT-PCR檢測BLM基因超表達后對Ran的影響 轉(zhuǎn)染細胞48 h后，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后采用SYBR Green熒光染料法檢測BLM和Ran基因的表達情況。熒光定量PCR反應體系：2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 5 μL、Sense Primer 0.5 μL、Anti-sense Primer 0.5 μL、cDNA 模 板 1 μL、ddH2O 3 μL、Total 10 μL，每個樣品做 3 個重復 ；反應條件：95℃預變性2 min、95℃變性30 s、60℃退火30 s，反應進行40個循環(huán)后分析溶解曲線。隨后，采用2-△△Ct方法對實時熒光定量PCR結(jié)果進行統(tǒng)計分析，2-△△Ct表示目的基因的相對表達量。最后采用SPSS Statistics 19.0 數(shù)據(jù)分析軟件和GraphPad Prism 5 圖形分析軟件分別進行相關數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析和圖表處理。

1.2.7 BLM蛋白在PC3細胞中表達量的檢測 提取轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-BLM載體36 h后的PC3細胞總蛋白，以轉(zhuǎn)染pEGFP-N3空載體的PC3細胞為對照，采用1.2.4中目標蛋白分離鑒定方法分離BLM蛋白，同樣方法轉(zhuǎn)膜封閉，隨后以抗BLM蛋白小鼠單克隆抗體為一抗4℃孵育過夜，HRP山羊抗小鼠二抗孵育1 h，ECL顯色，熒光化學發(fā)光成像系統(tǒng)分析BLM蛋白在PC3細胞中的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 pMD-19-BLM克隆載體的鑒定

以B1、B2、B3三段序列的連接產(chǎn)物為模板，擴增BLM基因 CDS序列，膠回收后連接pMD19載體，轉(zhuǎn)化JM109細胞。PCR檢測和雙酶切檢測結(jié)果分別見圖3。由圖3-A可見，6個質(zhì)粒在4 251 bp處均出現(xiàn)預期條帶；由圖3-B可見，KpnⅠ與XhoⅠ進行雙酶切后，結(jié)果1-4泳道均在4 251 bp和2 692 bp左右出現(xiàn)兩條亮帶。經(jīng)上海英駿生物技術(shù)公司對4個質(zhì)粒進行測序鑒定，測序結(jié)果經(jīng)MegAlign分析表明，3、4號質(zhì)粒BLM基因序列發(fā)生了移碼突變，2號質(zhì)粒盡在aa192位處發(fā)生有義突變，由天冬酰胺（N）突變?yōu)樘於彼幔―），其它均為無義突變，與GenBank中公布的BLM氨基酸序列（NM_000057）同源性最高。由于天冬酰胺屬于極性中性氨基酸，天冬氨酸屬于酸性氨基酸，兩者所帶R基團均具有一定的親水性，因此該氨基酸的突變對BLM解旋酶蛋白功能的影響不大，所以保藏2號質(zhì)粒對應菌株，作為后期構(gòu)建原核和真核表達載體的中間載體。

2.2 重組原核和重組真核表達載體的鑒定

將連接好的重組原核和重組真核表達載體分別轉(zhuǎn)化BL21和JM109細胞后，挑取陽性克隆進行培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，結(jié)果見圖4。由圖4-A可見，僅6號泳道質(zhì)粒在5 900 bp和4 251 bp出現(xiàn)目的條帶，大小符合pET-32a-BLM酶切圖譜，說明6號質(zhì)粒酶切成功。由圖4-B可見，1-5號泳道，均在4 700 bp和4251 bp出現(xiàn)兩條目的條帶，大小符合pEGFP-N3-BLM酶切圖譜。對酶切成功的原核和真核表達質(zhì)粒進行測序鑒定，并經(jīng)MegAlign序列比對軟件進行分析，結(jié)果顯示重組原核和重組真核表達載體與前期構(gòu)建成功的pMD19-BLM亞克隆載體序列同源性達100%，均可用于后期蛋白質(zhì)的表達實驗。

圖3 轉(zhuǎn)染JM109感受態(tài)細胞后PCR和雙酶切檢測pMD19-BLM

圖4 pET32-BLM和pEGFP-BLM表達載體的雙酶切檢測

圖5 BLM解旋酶在BL21中的表達

2.3 BLM解旋酶的在大腸桿菌中的表達結(jié)果

為研究BLM解旋酶在大腸桿菌中的最優(yōu)表達條件，實驗設置了5個IPTG濃度，兩個培養(yǎng)溫度，結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)IPTG終濃度對BLM解旋酶的表達影響不大，而溫度對BLM解旋酶的表達影響較大，且在25℃時表達量較高。Western-blot檢測結(jié)果（圖5-C）表明，構(gòu)建的pET-32a-BLM原核表達載體能夠在大腸桿菌中正確表達，且在25℃時表達量較高。

2.4 BLM基因的亞細胞定位

PSORT II Prediction分析軟件對BLM解旋酶氨基酸分析（表 2）表明，BLM蛋白87.0%集中在細胞核中表達，4.3%在細胞質(zhì)中表達，4.3%在細胞骨架中表達，4.3%在質(zhì)膜中表達。經(jīng)細胞轉(zhuǎn)染，DAPI染核處理，BLM解旋酶的熒光共定位結(jié)果（圖6）可見，GFP蛋白在整個中均有表達，而GFP-BLM融合蛋白主要集中在細胞核中表達，說明BLM主要在細胞核中表達，這與軟件預測結(jié)果相同。

表2 PSORT II Prediction軟件分析BLM蛋白的亞細胞定位

圖6 BLM解旋酶在PC3細胞中的熒光定位圖

2.5 Western bloting結(jié)果和熒光定量PCR結(jié)果

Western bloting結(jié)果（圖7-A）表明，轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-BLM后，與對照組相比，BLM解旋酶在翻譯水平獲得了超表達。熒光定量PCR結(jié)果（圖7-B）也表明，BLM基因在轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比實現(xiàn)了超標達，且達到了極顯著性差異（P＜0.01）；實驗組與對照組相比，蛋白入核相關基因Ran表達量下降，與對照組相比也達到了極顯著性差異（P＜0.01）。

圖7 BLM超表達后相關基因在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達情況

3 討論

在人類5種RECQ解旋酶中，BLM、WRN、RECQ4基因的突變分別會導致布魯姆綜合征（Bloom syndrome，BS）、 沃 納 綜 合 征（Werner syndrome，WS）和先天性血管萎縮皮膚異色綜合征（Rothmund Thomson syndrome，RTS）3 種不同的疾?。?］，其中BS患者最典型的特點是細胞中姐妹染色單體交換率（Sister chromatid exchanges，SECs）比正常人高出10倍。BLM基因編碼區(qū)為4 251 bp，編碼1 417個氨基酸殘基，蛋白分子量約為159 kD，由于全蛋白分子量大，難以表達純化，因此關于BLM全酶活性的研究一直受到限制。BLM639-1290區(qū)段含有Helicase、RecQ-Ct和HRDC結(jié)構(gòu)域，Helicase的主要功能是負責DNA的結(jié)合、易位、解鏈和偶聯(lián)ATP水解過程；RecQ-Ct作為RecQ解旋酶家族所特有的結(jié)構(gòu)域，具有DNA結(jié)合和解鏈的活性，也與蛋白質(zhì)折疊有關，但并不結(jié)合ATP；HRDC結(jié)構(gòu)域能輔助性結(jié)合DNA進而調(diào)節(jié)其解鏈功能，也可增強和穩(wěn)定BLM解旋酶與DNA的結(jié)合，但不具有催化活性［12］。因此，這3個結(jié)構(gòu)域共同組成了BLM解旋酶的核心區(qū)，并具有全酶類似的活性，已成為研究者開展BLM全酶功能研究的首選對象。然而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在缺乏C端的BLM639-1290核心區(qū)，蛋白亞細胞定位主要集中在細胞質(zhì)中，對BLM蛋白行使其主要功能造成較大影響。同時，最新研究也表明，BLM解旋酶N端關鍵氨基酸殘基的磷酸化、泛素化和類泛素化修飾在修復損傷的DNA［13-15］、增強蛋白間的相互作用維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性［16-17］、維持基因組（包括端粒和染色體）穩(wěn)定性［18-19］、促進細胞凋亡［4］等方面具有重要作用。可見BLM639-1290核心區(qū)在開展體內(nèi)功能驗證實驗時，不能準確反應BLM全蛋白的相關功能。

因此，本研究通過分段擴增的方法，旨在克隆BLM解旋酶全蛋白。結(jié)果成功克隆了人BLM解旋酶全CDS區(qū)，構(gòu)建了人BLM基因的重組原核表達載體pET-32a-BLM和重組真核表達載體pEGFP-N3-BLM。原核表達結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同IPTG濃度對BLM蛋白的表達影響不大，低溫有助于BLM蛋白表達量的提高，但在室溫環(huán)境25℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min條件下，BLM蛋白主要以包涵體形式存在。研究表明，外源基因在大腸桿菌中的表達與多重因素有關，例如蛋白分子量的大小、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、IPTG濃度以及培養(yǎng)液營養(yǎng)物質(zhì)的豐富程度等，低溫、低轉(zhuǎn)速及適當降低培養(yǎng)基營養(yǎng)成分均有助于蛋白質(zhì)的可溶性表達，因為在這些條件下，細菌生長緩慢，不易形成包涵體。因此，根據(jù)論文實驗結(jié)果，后期應在同一IPTG濃度下，開展不同低溫條件、不同低搖床轉(zhuǎn)速、及不同營養(yǎng)成分培養(yǎng)基條件下的蛋白表達條件優(yōu)化實驗。

真核表達結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PSORT II Prediction軟件和亞細胞定位結(jié)果均表明BLM全蛋白的亞細胞定位主要集中在細胞核中，部分在細胞質(zhì)中，其中細胞核中占87.0%，細胞質(zhì)中占4.3%，細胞骨架中占4.3%，質(zhì)膜中占4.3%；這與該蛋白在細胞質(zhì)核糖體中合成，隨后轉(zhuǎn)運至細胞核中行使其主要生理功能相吻合。此外，為進一步證明BLM蛋白主要在細胞核中表達，本研究通過熒光定量PCR試驗，檢測入核關鍵蛋白Ran的表達情況。Ran 蛋白是一種 G 蛋白，與單分子鳥嘌呤核苷酸形成結(jié)合體（Ran-GTP）調(diào)節(jié)被轉(zhuǎn)運物復合體的組裝和解體，在細胞核中釋放出攜帶NLS 的靶蛋白［20］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-BLM質(zhì)粒48 h后，BLM基因?qū)崿F(xiàn)了超表達，而Ran基因表達量卻有所下降。分析原因，可能主要與檢測時間點的選擇有關。轉(zhuǎn)染后48 h雖然BLM仍處于高表達狀態(tài)，但細胞為維持自身正常生命代謝，可能會通過調(diào)節(jié)Ran蛋白的表達量來阻止BLM的持續(xù)入核，因此在48 h 檢測Ran基因，其表達量在轉(zhuǎn)錄水平會明顯降低。Western Blotting檢測證實構(gòu)建的真核表達載體和原核表達載體均能在PC3細胞和BL21細胞中表達出一個分子量約為179 kD 的蛋白質(zhì)，與預測分子量大小基本一致，說明構(gòu)建的兩個表達載體正確無誤。

4 結(jié)論

成功克隆了BLM基因CDS區(qū)，構(gòu)建了pEGFPN3-BLM真核表達載體和pET-32a-BLM原核表達載體，并通過亞細胞定位實驗證明了BLM蛋白主要在細胞核中表達，Western Blotting實驗證實論文構(gòu)建的原核表達載體和真核表達載體均能在相應的宿主細胞中正確表達。